הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה
Summary
כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.
Abstract
Neurites, גם דנדריטים ואקסונים, הם תהליכים תאיים עצביים המאפשרים ההולכה של דחפים חשמליים בין תאי עצב. הגדרת המבנה של neurites היא קריטית להבנה כיצד תהליכים אלה להעביר חומרים ואותות שתומכים בתקשורת הסינפטי. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כבר משמש באופן מסורתי כדי להעריך את תכונות ultrastructural בתוך neurites, עם זאת, החשיפה לממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף יכולה לעוות מבנים. מטרה שלא סופקו חשובה היא גיבוש נהלים המאפשרים להערכות מבניות אינם מושפעות מממצאים כאלה. הנה, הקמנו פרוטוקול מפורט ולשעתק לגידול וneurites כל הקפאה-הבזק של נוירונים עיקרי שונה ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבדיקה שלהם עם טומוגרפיה האלקטרונים cryo-(cryo-ET). טכניקה זו מאפשרת להדמיה 3-D של neurites הקפואה, התייבשות ברזולוציה ננומטר, בהנחיית assessment של ההבדלים מורפולוגיים שלהם. הפרוטוקול שלנו מניב תצוגה חסרת תקדים של הגנגליון הגבי שורש neurites (DRG), ויזואליזציה של neurites בהיפוקמפוס במדינה הקרובה למולדתם. ככזה, שיטות אלה ליצור בסיס למחקרים עתידיים בneurites של שני נוירונים נורמלים ואלה מושפעים מהפרעות נוירולוגיות.
Introduction
נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי.
במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון – ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים 4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר 12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל 1.
בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET 8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית 10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית 8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM 10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד 17 זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב.
בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה.
הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו מראים שנוירונים חולדה עובריים (גנגליון שורש הגבי והיפוקמפוס) ניתן לגדל במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM) וקפוא בקרח זגוגי רזה מספיק neurites להיות צילמה באמצעות 2-D cryo-EM וcryo-3-D ET. בעוד neurites בהיפוקמפוס בעבר צילמה באמצעות cryo-ET 8,10,18,23, פרוטוקול מפורט מספיק לשכפול מ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה כבר נתמך על ידי מענקי NIH (PN2EY016525 וP41GM103832). SHS נתמכה על ידי מענק מהתכנית ללימודי ההדרכה Nanobiology בינתחומי של מרכז קק WM להבינתחומי Bioscience הדרכה של חוף מפרץ קונסורציומים (NIH גרנט מס T32EB009379).
SHS גזור, גדל ומזוגג DRG ותאים בהיפוקמפוס, שנאסף cryo-EM ונתונים cryo-ET של DRG ואקסונים בהיפוקמפוס; שוחזר וצבע-מבואר סדרת ההטיה. MRG גזור וסיפק תאים בהיפוקמפוס במעבדה של MNR. SC סייע בביאור סדרת הטיה. SHS הוכשר על ידי CW על כיצד לנתח ולגדול נוירונים. SHS, WCM והמקלחת הגו את הניסויים. SHS הכין את כתב היד עם קלט ממחברים אחרים.
וידאו זה צולם במרכז לסלולרי הדמיה וNanoAnalytics (C-Cina) של Biozentrum של tהוא באזל האוניברסיטה. C-Cina משתלב במחלקה לBiosystems מדע וההנדסה (D-BSSE) של המכון הטכנולוגי של ציריך, הממוקם בבאזל, שוויץ.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
Referencias
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neurociencias. 108, 493-506 (2001).
