Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor
Summary
Vi presentiamo un metodo rapido, immobilizzazione reversibile di piccole molecole e gruppi di nanoparticelle funzionalizzate per Surface Plasmon Resonance (SPR) studi, utilizzando sequenziale acquisizione on-chip bioorthogonal chimica di cicloaddizione e antigene-anticorpo.
Abstract
Metodi per l'immobilizzazione rapida superficie di piccole molecole bioattive controllanti orientamento e la densità di immobilizzazione sono altamente desiderabile per applicazioni di biosensore e microarray. In questo studio, usiamo un bioorthogonal altamente efficiente covalente [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) per consentire l'immobilizzazione microfluidica di molecole TCO / Tz-derivatizzate . Controlliamo il processo in tempo reale, in condizioni di flusso continuo con risonanza plasmonica di superficie (SPR). Per attivare immobilizzazione reversibile ed estendere la gamma sperimentale della superficie del sensore, si combinano un componente della cattura non covalente antigene-anticorpo con la reazione di cicloaddizione. Alternativamente presentando TCO o Tz porzioni di superficie del sensore, più processi cattura-cicloaddizione sono ora possibile su una superficie del sensore per gli studi di assemblaggio e di interazione on-chip di una varietà di strutture multi-componente. Abbiamo illustrate questo metodo con due diversi esperimenti immobilizzazione su un chip biosensore, una piccola molecola che si lega, AP1497-FK506 binding protein 12 (FKBP12), e la stessa piccola molecola come parte di una nanoparticella situ-funzionalizzati immobilizzato e in.
Introduction
Le reazioni di coniugazione efficienti sono strumenti preziosi per il fissaggio molecole bioattive alle superfici per una varietà di applicazioni biotecnologiche. Recentemente, il bioorthogonal molto veloce [4 +2] reazione di cicloaddizione tra trans-cicloottene (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) è stato utilizzato per etichettare superfici cellulari, strutture subcellulari, anticorpi e nanoparticelle 1. – 7 Qui, usiamo la [4 +2] cicloaddizione reazione in combinazione con la cattura antigene / anticorpo (GST / anti-GST) per le reversibili sintesi on-chip di strutture multi-componente per Surface Plasmon Resonance (SPR) analisi dell'interazione e monitoriamo l' processo in tempo reale (Figura 1). 8,9 In particolare, la strategia cattura-cicloaddizione ha la rigenerazione superficie utilizzando un protocollo prestabilito. 8 Di conseguenza, il montaggio di superficie dei sensori stabili controllanti orientamento ligando e densità per varietà di nuovo saggio Formati è ora possibile. Utilizzoquesta strategia si dimostra l'immobilizzazione di piccole molecole TCO / Tz-derivatizzati e caratterizzare i tassi di cicloaddizione in una varietà di condizioni di buffer. Abbiamo scelto l'interazione noto tra FKBP12 e un AP1497 molecola che si lega FKBP12 10-12 come esempio per verificare che la strategia cattura-cicloaddizione conserva la capacità della piccola molecola di interagire con il proprio obiettivo quando sia direttamente collegato agli antigeni immobilizzati GST o alle nanoparticelle immobilizzati (NPS).
Questo metodo offre diversi vantaggi. In primo luogo, l'immobilizzazione reversibile di piccole molecole su chip del sensore è ora possibile. In secondo luogo, TCO / Tz immobilizzazione di piccole molecole consente anche studi di interazione label-free che invertire l'orientamento di studi SPR canoniche, e può fornire una visione complementare di un'interazione vincolante. In terzo luogo, questo metodo consente la sintesi microfluidica di nanoparticelle mirati e valutazione immediata della loro bindinag proprietà. Questo promette di migliorare l'efficienza di valutazione o di screening nanoparticelle mirati, e anche diminuire la quantità di nanoparticelle richiesti. 13-15 Quarto, questo approccio può misurare la cinetica di reazione delle reazioni di cicloaddizione bioorthogonal in tempo reale in flusso continuo. Infine, l'immobilizzazione chimica TCO / Tz è robusta in presenza di siero. Presi insieme, prevediamo che questo approccio versatile sarà ampiamente facilitare la costruzione di superfici sensori stabili per un'ampia varietà di studi microfluidici rilevante per in vitro e in vivo applicazioni cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di cattura-cicloaddizione qui descritta consente una rapida, immobilizzazione reversibile di nanoparticelle modificate e piccole molecole di interazione basato su chip privo di etichetta e studi cinetici. Il protocollo immobilizzazione può essere eseguita in pochi minuti richiedono <10 pM concentrazioni di ligandi piccole molecole. Modulando la concentrazione del ligando e densità di immobilizzazione tempo di contatto può essere strettamente controllata. I nostri dati mostrano che le reazioni bioorthogon…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo finanziamento dal NIH (NHLBI contratto n HHSN268201000044C a Rw, SH e SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Referencias
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