MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri
Summary
Havaya duyarlı bir titanyum ve vanadyum anti-kanser ajanlarının sentezi için bir yöntem olup, MTT testi ile insan kanser hücre çizgisi karşı sitotoksik aktivitenin değerlendirilmesi ile birlikte tarif edilmiştir.
Abstract
Titanyum (IV) ve vanadyum (V) komplekslerinin yüksek ölçüde kuvvetli anti-kanser ajanlardır. Bunların sentezinde bir meydan okuma hidrolitik kararsızlık anlamına gelir, bu nedenle bunların hazırlanması bir inert atmosfer altında yapılmalıdır. Bu komplekslerin Antikanser aktivitesinin değerlendirilmesi MTT deneyi ile elde edilebilir.
MTT deneyi, bu canlı hücreler maruz kaldığı zaman formazan MTT molekülün enzimatik azalma dayanan kolorimetrik canlılık deneyidir. Indirgeme sonucu, MTT molekülünün bir renk değişimdir. Bir kontrole göre emme ölçümleri bileşik, anti-kanser aktivitesi ve IC50 değerlerine çevrilmiştir bir test edilen bileşiğin, değişen konsantrasyonları ile tedavi sonrası canlı kalan kanser hücrelerinin yüzdesini belirlemek. MTT deneyi doğruluğu, hız ve nispi basitliği nedeniyle sitotoksisite çalışmalarda yaygın olarak yaygındır.
Burada biz preHücre plakaların hazırlanması hücreleri ile inkübe bileşiklerin dahil olmak üzere hava duyarlı metal bazlı ilaç ve hücre canlılığı ölçümlerin sentezi için ayrıntılı bir protokol gönderilen, MTT deneyi ve IC50 değerlerinin tayini kullanılarak canlılığı ölçümleri.
Introduction
Kemoterapi hala çeşitli kanser hastalıkları için klinikte kullanılan tedavilerin temel derslerden biridir ve araştırma böylece büyük miktarda yeni ve geliştirilmiş antikanser ilaçlar geliştirmek amacı ile dünya çapında yapılır. Bu tür çalışmalar, daha çok in vitro sitotoksik biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesi ardından bileşiklerin tasarımı ve hazırlığı ile, kimyasal düzeyinde başlar. Hücre canlılığı, hücresel aktivite 1-2 ile ilgili bilgi sağlayacak çeşitli deneyleri ile değerlendirilebilir.
Cisplatin yaygın olarak testis ve yumurtalık kanserlerinde 3-4 için ağırlıklı olarak etkili bir tedavi olarak kabul edilir bir kemoterapötik ajan olarak kullanılan bir platin kompleksi bir örnektir. Bununla birlikte, dar bir aktivite yelpazesi ve ciddi yan etkiler diğer kuvvetli geçiş metali komplekslerinin 5-8 çalışmaları tetikler. Diğerlerinin arasında, titanyum (IV) ve vanadyum (V) kompleksleri, yüksek aktivite ümit verici sonuçlar göstermiştir ve azaltılmıştoksisite 9-16. Ti (IV) kompleksleri nedeniyle bu özelliklerinden sisplatin sonrasında klinik denemeler girmek için ilk idi, ancak onlar yüzünden formülasyon zorluklar ve hidrolitik istikrarsızlığa denemeler başarısız olmuştur. Su direnci 15,17-21 yüksek anti-kanser aktivitesi birleşebilmektedir, bu metal komplekslerinin gelişmiş türevlerini geliştirmek için geçerli bir ihtiyaç vardır.
Ti (IV) ve V hazırlanmasında bir sorun (V) kompleksleri öncü reaktifleri hidrolitik kararsızlık anlamına gelir ve bu nedenle, atıl bir atmosfer muhafaza edilmelidir. Ti (IV) ve V (V) bileşiklerinin hazırlanması Bir eldiven kutusu ya da bir Schlenk hat teknikleri kullanılarak N, 2 veya Ar koşullar altında gerçekleştirilmektedir.
Tahlil – anti-kanser etkinliğinin değerlendirilmesi için yaygın bir yöntem, MTT ((4,5-Dimetiltiazolil) -2,5-difeniltetrazolyum bromür 3) üzerine dayanmaktadır. Bu deney, Mosmann 1983 sunulan bir kolorimetrik canlılık deneyidir22. Bu, son derece iyi çalışılmış ve karakterize edici özelliği, ve nedeniyle hassas, hız ve hücre çizgilerinin çeşitliliği uygulanacak yeteneği yeni sitotoksik bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek zaman yüksek verimli olarak kabul edilir. Bu deney, bu canlılığı yaşayabilir hücrelerin maruz kaldığı MTT molekülün renk değişikliğine dayanmaktadır. Canlı hücre sayısı ile orantılıdır emme, ve muamele edilmemiş kontroller ile karşılaştırıldığında ölçülmesi, test edilen bileşiğin, hücre büyüme inhibisyonu yetenekleri değerlendirilmesini sağlar.
MTT kolorimetrik deneyi, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde 23 olarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler, test edilen ilaç eklenmesinden önce kuyularda, bir ön kuluçka gerektirebilir. Inkübasyon saatleri hücre hattı özelliklerine bağlı olarak 0-24 saat arasında değişebilir. Hücreler, genellikle, ilaç aktivitesine bağlı olarak 24-96 saat boyunca ilaca maruz kalmaktadır. MTT çözeltisi daha sonra bağırma muamele edilmiş hücrelere ilave edilirow MTT (Şekil 1) 24 canlı hücrelerde işlevsel olan mitokondrial ve sitosolik enzimlerin çeşitli mor formazan indirgenir. MTT molekül ölü hücre ya da kırmızı kan hücrelerinin (metabolik açıdan aktif olmayan hücre), dalak hücreleri (dinlenme hücreleri) ve konkanavalin A ile uyarılan lenfosit (aktif hücreler) 22 ile azaltılmaz. MTT formazan çökeltiler ile inkübasyon 3-4 saat sonra. Formazan oluşumu inkübasyon 0.5 saat sonra başlar, ama en iyi sonuçlar için en az 3 saat 22 boyunca MTT hücreleri ortaya çıkarmak için en iyisidir. Sonuç olarak, yetiştirme ortamı çıkarıldı ve DMSO da 26 kullanılabilir olmasına rağmen, formazan, organik bir çözücü, tercihen de 25 izopropanol içinde eritilir. Ortamın ortadan kaldırılması büyüme ortamı içinde çok yaygın olan fenol kırmızı, bu yana doğru sonuçlar elde etmek, ve proteinler absorbans ölçümü 25 engelleyebilir çökeltilmesi için çok önemlidir. Ne zaman formazan çözelti, çözeltinin absorbansı, bir mikro-plaka okuyucu spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür, homojen ulaşır. 550 nm'de absorbans, oyuk başına 200-50.000 hücre aralığındaki hücre sayısı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle hücre çok küçük miktarlarda 22 tespit edilebilir. Absorbans ilaç ile tedavi sonrasında kalan canlı hücre miktarı belirtir ve ilaca maruz bırakılmamış kontrol hücreler absorbans ile karşılaştırılır. Uygun yazılım ile sonuçların analizi IC 50 (inhibisyon konsantrasyon,% 50) içerir ve bunların değerlerinin istatistiksel hatalar ölçümün kaç kez tekrar göre.
MTT deneyi doğruluğu ve göreli basitliği nedeniyle yeni antikanser bileşikleri, taranması için sitotoksisite çalışmalarında yaygın olarak yaygındır. Enzimatik reaksiyon bağlı olan MTT tahlili kullanarak, ancak, bir çeşitli enzim inhibitörleri MTT An indirgenmesini etkileyebilir dikkat edilmesi gereken hususlaryanlış sonuçlara yol 27 d. Buna ek olarak, MTT deneyi, ilacın 2 sitotoksik aktivitesinin moleküler mekanizma hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda tarif edildiği gibi bir yöntem, biyolojik hücre canlılığı deneyi ile, kimyasal sentez birleştirir. Canlı hücreler ile ilgili herhangi bir biyolojik yöntemlerle olduğu gibi, laminar bir kaput çalışma ve steril organik çözücülerin kullanılması dahil olmak üzere steril koşullar korumak için çok önemlidir. Ayrıca, hidrolitik olarak stabil olmayan metal bazlı ilaçların hazırlanması ve depolanması için olan bir eldiven kutusu ya da bir Schlenk hat teknikleri kullanılması gerekmek…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi alındı / ERC Hibe sözleşmesi hiçbir [239603]
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
Referencias
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
- Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
- Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
- Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
- Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival – Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival – Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Investigación sobre el cáncer. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. . Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
