المضادة للسرطان المعادن مجمعات: التجميعي والتقييم السمسة قبل الفحص الإنتقالي العسكري
Summary
ووصف طريقة لتوليف التيتانيوم والفاناديوم وكلاء المضادة للسرطان الحساسة الهواء، جنبا إلى جنب مع تقييم النشاط السامة للخلايا نحو خط الخلايا السرطانية البشرية التي MTT الفحص.
Abstract
التيتانيوم (IV) والفاناديوم (V) المجمعات وكلاء المضادة للسرطان قوية للغاية. ويتمثل التحدي في التوليف يشير إلى عدم استقرارها المائي، وبالتالي ينبغي أن تتم إعدادها في إطار جو خامل. لا يمكن أن يتحقق تقييم النشاط المضادة للسرطان من هذه المجمعات من قبل مقايسة الإنتقالي العسكري.
مقايسة الإنتقالي العسكري هو فحص الجدوى اللونية على أساس الحد الأنزيمية للجزيء الإنتقالي العسكري لformazan عندما يتعرض لخلايا قابلة للحياة. نتائج التخفيض هو تغيير لون جزيء الإنتقالي العسكري. قياسات الامتصاصية النسبي لعنصر تحكم تحديد نسبة الخلايا السرطانية المتبقية بعد العلاج قابلة للحياة مع تركيزات مختلفة من مركب اختبار، والتي تترجم إلى نشاط مضاد للسرطان مجمع وقيمها IC 50. مقايسة الإنتقالي العسكري هو شائع على نطاق واسع في دراسات السمية الخلوية نظرا لدقتها، سرعة، والبساطة النسبية.
نحن هنا قبلأرسلت بروتوكول مفصلة لتركيب الأدوية الهواء المعدنية الحساسة أساس القياسات وبقاء الخلية، بما في ذلك إعداد لوحات الخلايا، الحضانة من المركبات مع خلايا، وقياسات حيوية باستخدام مقايسة الإنتقالي العسكري، وتحديد IC 50 القيم.
Introduction
العلاج الكيميائي لا تزال واحدة من الدورات الرئيسية من العلاجات المستخدمة في عيادة لأمراض السرطان المختلفة، وتتم بالتالي كمية كبيرة من البحوث في جميع أنحاء العالم بهدف تطوير الأدوية المضادة للسرطان جديدة ومحسنة. تبدأ هذه الدراسات في معظمها على مستوى الكيميائية، مع تصميم وإعداد المركبات، تليها التقييم البيولوجي من الخصائص السامة للخلايا في المختبر. يمكن تقييم الجدوى الخلية المقايسات المختلفة التي تقدم معلومات عن النشاط الخلوي 1-2.
سيسبلاتين هو مثال من مجمع البلاتين الذي يستخدم على نطاق واسع كدواء العلاج الكيميائي، الذي يعتبر علاج فعال لسرطان الخصية أساسا والمبيض 3-4. ومع ذلك، في نطاق النشاط الضيقة وآثار جانبية خطيرة تؤدي إلى دراسات أخرى المجمعات المعادن التي تمر بمرحلة انتقالية قوية 5-8. من بين أمور أخرى، والتيتانيوم (IV) والفاناديوم (V) مجمعات أظهرت نتائج واعدة من ارتفاع النشاط وانخفاضسمية 9-16. وكانت منظمة الشفافية الدولية (IV) مجمعات أول من يدخل التجارب السريرية بعد سيسبلاتين بسبب هذه الخصائص، إلا أنها فشلت المحاكمات بسبب صعوبات صياغة وعدم الاستقرار المائي. وبالتالي هناك حاجة لتطوير وتحسين الحالية مشتقات هذه المجمعات المعدنية التي قد تجمع بين النشاط المضادة للسرطان عالية مع مقاومة للماء 15،17-21.
ويتمثل التحدي في إعداد تي (IV) والخامس (V) مجمعات يشير إلى عدم الاستقرار المائي من الكواشف السلائف، وبالتالي، ينبغي الحفاظ على جو خامل. ويجري إعداد تي (IV) والخامس (V) مركبات تحت رقم 2 أو وصول الأوضاع في علبة القفازات أو باستخدام تقنيات خط Schlenk.
ويستند أسلوب واحد مشترك لتقييم النشاط المضاد للسرطان على الإنتقالي العسكري (3 – (4،5-dimethylthiazolyl) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium) مقايسة. هذا الفحص هو فحص الجدوى اللونية التي قدمت في عام 1983 من قبل Mosmann22. ودرس بشكل جيد للغاية، وتميزت، ويعتبر كفاءة عالية عند تقييم فعالية من المركبات السامة للخلايا جديدة نظرا لدقتها، سرعة، وقدرتها على أن تطبق على مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. ويستند هذا الاختبار بقاء على تغير لونها للجزيء MTT عندما يتعرض لخلايا قابلة للحياة. قياس الامتصاصية، والتي تتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة، وبالمقارنة مع الضوابط دون علاج، يمكن تقييم قدرات تثبيط نمو الخلايا المجمع اختبارها.
ويجري الفحص اللونية الإنتقالي العسكري في لوحة شكل 96-23 بشكل جيد. قد تتطلب الخلايا حضن مسبق في الآبار قبل إضافة المخدرات التي تم اختبارها. قد تختلف أوقات حضن مسبق 0-24 ساعة وفقا لخصائص خط الخلية. وعادة ما تتعرض الخلايا إلى المخدرات ل24-96 ساعة اعتمادا على النشاط المخدرات. ثم يضاف محلول MTT إلى الخلايا المعالجة، حيث يصيحآه هو انخفاض الإنتقالي العسكري لformazan الأرجواني من قبل مجموعة متنوعة من الانزيمات الميتوكوندريا وعصاري خلوي التي هي خلايا قابلة للحياة العملية في (الشكل 1) 24. لا يتم تقليل جزيء الإنتقالي العسكري من قبل الخلايا الميتة أو خلايا الدم الحمراء (أيضي الخلايا غير نشط)، وخلايا الطحال (الخلايا يستريح) والخلايا الليمفاوية كونكانافالين حفز A (خلايا تنشيط) 22. بعد 3-4 ساعة من الحضانة مع MTT يترسب formazan. تشكيل formazan يبدأ بعد 0.5 ساعة من الحضانة ولكن من أجل تحقيق النتائج المثلى فمن الأفضل لفضح الخلايا لMTT لا يقل عن 3 ساعة 22. بالتالي، تتم إزالة المتوسطة المتنامية ويذوب formazan في المذيبات العضوية، ويفضل الأيزوبروبانول 25، على الرغم من DMSO يمكن أن تستخدم أيضا 26. القضاء على المتوسط أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج دقيقة منذ الفينول الحمراء، وهو أمر شائع على نطاق واسع في النمو متوسطة، وعجل البروتينات يمكن أن تتداخل مع قياس الامتصاصية 25. عندما شكليةالحل زان يصل متجانسة، يتم قياس الامتصاصية من الحل باستخدام مطياف قارئ صفيحة ميكروسكوبية. الامتصاصية في 550 نانومتر يتناسب طرديا مع عدد الخلايا في نطاق من الخلايا 200-50،000 لكل بئر، وبالتالي كميات صغيرة جدا من الخلايا يمكن أن يتم الكشف عن 22. الامتصاصية يشير إلى كمية خلايا قابلة للحياة التي بقيت بعد العلاج مع الدواء، ويتم مقارنة الامتصاصية من الخلايا السيطرة التي لم تتعرض لهذا الدواء. تحليل النتائج والبرامج المناسبة يوفر (تركيز تثبيط؛ 50٪) IC 50 القيم والأخطاء الإحصائية على أساس عدة تكرار القياس.
مقايسة الإنتقالي العسكري هو شائع على نطاق واسع في دراسات السمية الخلوية لفحص المركبات المضادة للسرطان جديدة، نظرا لدقتها والبساطة النسبية. ومع ذلك، عند استخدام الفحص الإنتقالي العسكري الذي يعتمد على رد الفعل الأنزيمية، يجب على المرء أن نعتبر أن مختلف مثبطات الإنزيم يمكن أن يؤثر على الحد من الإنتقالي العسكري لد يؤدي إلى نتائج خاطئة 27. بالإضافة إلى ذلك، لا مقايسة الإنتقالي العسكري لا يوفر أي معلومات عن آلية الجزيئية النشاط السامة للخلايا من المخدرات 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة يجمع بين التركيب الكيميائي البيولوجي مع مقايسة بقاء الخلية. كما هو الحال مع أي الأساليب البيولوجية المتعلقة خلايا قابلة للحياة، فمن الأهمية بمكان أن تعمل في غطاء محرك السيارة الصفحي، والحفاظ على ظروف معقمة، بما في ذلك استخدام المذيب?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقت تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7/2007-2013) / ERC اتفاق منحة لا [239603]
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
Referencias
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
- Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
- Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
- Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
- Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival – Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival – Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Investigación sobre el cáncer. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. . Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
