マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

1。機材の準備：フローチャンバー、ピペット、およびソリューションチャンバーフロー：孤立した内皮チューブ（ 図1A参照 ）を表面かん流するために底部にある24ミリメートル×50ミリメートルガラスカバースリップでフローチャンバーを使用してください。チャンバを組み立てる前に、超純水でリンスし、3％HClおよび70％エタノールの両方でカバーガラスを洗浄し、窒素ガスで乾燥した。 ピペット：ピペット、3つの異なるタイプは、プロトコル中に使用されています。カニュレーション、粉砕、およびピン止め。カニューレ挿入およびピン止めピペットの両方が実験の日の前に行うことができますが、チュレーションピペットは、それが適切に内腔の大きさに血管の直径の知識を必要とするように当日なされるべきである。 カニューレ挿入ピペット：長いテーパー端部を有するようにマイクロピペットプラーを用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張る、内腔から赤血球をフラッシュするために。外径が約30％ルにピンセットで端を破る動脈（〜50〜80ミクロン）よりもカテゴリー、火災滑らかに先端を研磨（ 図1Bを参照）。約45°までの角度ピペットの先端をもと便利です。 摩ピペット機械的にホウケイ酸ガラスキャピラリー管からピペットをトリチュレートすること、内皮チューブから平滑筋細胞および外膜を解離する。上記のようにキャピラリーチューブを用意し、ピンセットで端を破る。ヒント：それは簡単にきれいにチュレーションピペットガラスの厚い壁を破るためにガラス罫書き装置を使用してください。実験の日に決定された内部直径にピペットを壊し、約10〜20ミクロン内皮管が分離されるから、血管の外径よりも大きい。ファイアーポリッシュ壊れ終了滑らかになるまで（ 図1Cを参照）。 ピペットをピン止め：フローチャンバー内内皮チューブを安定化させるために、内皮tを確保するためにピペットを固定しますチャンバーのカバースリップの底にUBE。カニューレ挿入ピペットと同様にガラスキャピラリーチューブを引き出します。先端が密閉されるまで、〜100μmの直径と、火災のポリッシュにピンセットで端を壊し、丸め、滑らかな（ 図1D参照 ）。注：ピン止めピペットの先端が完全に密封されていない場合には、流体が内腔に入り、実験結果を混乱させることができる。 ソリューション：超純内のすべてのソリューション（18.2MΩ）、H 2 Oを用意し、0.2μmのフィルターを介してそれらを殺菌する。解決策の浸透圧は285から300ミリオスモルの間にあることを確認します。 4℃で保存した場合のソリューションは、約2週間のために良いのまま解剖溶液：優れた腹部動脈の切開中に使用される塩溶液（ミリモル/ L単位）から構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、10mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（ HEPES）、10グルコース、0.01ニトロプルシドナトリウム（SNP）、dは、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）7.4のpHを有する。 NOドナーSNP動脈にカニューレを挿入し、トリチュレーションの際に、平滑筋細胞の除去を容易にするために容易にそれらを作る従って、平滑筋細胞をリラックスするために含まれる。 解離溶液：内皮管の解離の際に使用される塩溶液（ミリモル/ L）で構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、10 HEPES、10グルコース、2のCaCl 2、および0.1％BSA、 7.4のpH。この緩衝液1mlアリコートに、追加します。0.62 mg / mlのパパイン、1.5 mg / mlのコラゲナーゼおよび1.0 mg / mlのジチオエリスリトールを。異なるサプライヤーからの酵素は、酵素活性の様々なレベルを持つことができるので、この作業のために使用されているものの製品番号は、材料のテーブルの参照のために含まれています。注：プロトコル中に酵素による解離緩衝液、解離緩衝液の両方が異なるステップで使用される。 灌流液：生理食塩水（PSS）はsuperfusinに使用gで単離された内皮管が（ミリモル/ L単位）から構成されている：137のNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、10 HEPES、10グルコースおよび2のCaCl 2、7.4のpHを有する。 手術手順を開始する前に、緩衝液および溶液を準備します。 200ミリリットルの三角フラスコに4℃、分量解剖バッファーの50ミリリットルからソリューションを削除し、氷の上に置きます。また、解離の分量50ミリリットルは、酵素なしでバッファリングし、室温に平衡化する作業台の上に置きます。 4℃から灌流液を取り外して、作業台の上に室温に平衡化させる。 2。動物の準備動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、 実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所と一致していることを確認してください。ここで説明する手順は、大学の動物実験委員会によって承認されたミズーリ。 男性または少なくとも9週齢の雌マウスを使用して、個別に研究を行っている。腹腔内（ip）注射により、ペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）をして、マウスを麻酔。ヒント：注射は過剰摂取の可能性を低減する前に、滅菌生理食塩水に10 mg / mlのにペントバルビタールを希釈する。 麻酔妥協温度調節は、そのマウスがペントバルビタールの最初の注射の直後に保温。 （〜37℃に校正）加熱プレートの上に金属製フレーム（換気されたアルミニウム製バスケット）を使用すると、安定したマウスの温度を維持するために適しています。別の方法として、マウスから適切な距離を置いて、それを配置するように注意しながら、加熱ランプを使用しています。麻酔の適切なレベルを（TOEまたは尾のピンチに撤退の欠如）が達成されるまで、マウスごとに5〜10分を監視します。補足投与量は、15〜20分後に必要になることがあります。それは、特に、肥満の高齢者、または動物と、過剰摂取を避けるために、ゆっくりと慎重に進めるのがベストですそうでないと強調しね。 慎重に、小さなペットの毛をバリカンで、それを削って腹側から髪を削除します。特に注意は、動物への外傷を避けるように注意する必要があります。それは、陰部に脇の下にまたがる領域からすべての毛を削除すると便利です。新鮮なアルコール綿で任意の緩くしがみつい髪を削除します。 可能な限り腹壁をできるだけ多く公開するように広げ、両方の前後と後肢で横たわって、その背中の上でマウスを置きます。必要に応じて、スプレッドイーグル的に足を確保するために実験室のテープを使用しています。 3。優れた心窩部動脈の分離ただ陰部の領域の上に、皮膚を通して小さな切開を行います。基本的な腹部の筋肉へのダメージを回避しながら、皮膚のみが切断されていることを確認し、それぞれの後肢に出各方向に横切開を延長する。胸郭の上部に腹側正中に沿って頭側に切開を継続し、Nそれぞれの前肢に各方向に横切開を延長する。 優しく皮膚を持ち上げ、（ 図3Aを参照）、それにより腹部の筋肉組織の全面を露出させる、下の筋肉に皮膚を保持している結合組織を切断する鋏を使用。室温に0.9％食塩溶液で露出筋肉を洗浄。 SEAの小さなサイズのため、更なる手続きのための実体顕微鏡の下に動物を配置します。ピンセットで胸骨の一番下にある脂肪体を持ち上げ、それを介して切開する。下にある組織にあまりにも深く切らないように確認しながら、底のリブに沿って切開を続ける。 SEAは、表示する必要がある、それを損傷しないように注意してください。切開が完了したら、室温で0.9％食塩水で露出した組織を灌漑。 骨格筋の上部層が引き込まれた後、SEAおよび下の筋肉が容易に識別される。ヒント：の長さに注意してください元の長さに近づけるために（分離の際、軸に沿って短縮）内皮チューブを拡張するために分離する前に、 生体内の海。鉗子およびハサミを使用して、慎重にSEAの下に薄い筋肉層を切り出す。 傾斜した鉗子を使用して、SEAの下に6-0絹縫合糸の長さを通過し、その後の単離および洗浄中に可視化を容易にするために、血管内腔の中に保持し、加圧された血液に保つために動脈とその隣接する静脈を結紮。 反対側の海のライゲーション手順を繰り返します。 両方のSEAがライゲートされると、それぞれの側面を分離するために腹筋の正中線に沿って切開する。 肌のために行ったように、完全に身体から腹筋を分離するために垂直方向に外縁に沿って切開を継続して、それぞれの方向に横切開を拡張します。加圧された内腔を維持するために海に供給血管系への損傷を防ぐ。 C言語シールを維持し、4℃の解剖緩衝液10mlを含む50ミリリットルのビーカーに孤立筋肉や動脈を配置し、連結の上に海がUT。 腹部の反対側のための手順を繰り返し、10分間解剖バッファ内の組織をインキュベートする。 （ 図3Bを参照）解剖バッファーを含む冷却（4℃）解剖室の海を含む腹筋を配置します。解剖室は下部のシルガード（ポリジメチルシロキサン[PDMS]）の層でペトリ皿で​​構成されています。 虫ピン（0.15ミリメートル）を使用して、in vivoでの長さ（上記）を近似し、シルガードに固定し孤立海と腹部の筋肉を伸ばす。ヒント：腹膜に直面して薄い層が上になるように筋肉を方向付けるには、透視を使用して海が容易に見えることができます。 細かいマイクロダイセクションの楽器を利用しての方にライゲーションの上流サイトから作業下流端、最初の主要なブランチサイト（1-2 CM）まで、その対に静脈周囲の組織から海をオフにします。それからちょうどブランチサイトの上下だけで結紮下にカットしてSEAを切り出す。 血管内腔の中に保持している血液を除去し、海にカニューレを挿入し、氷冷解剖バッファーでそれをフラッシュします。シラスティックチューブの一部を使用して、氷の冷たい解剖バッファーを含む5ミリリットルのシリンジにカニューレ挿入ピペットのバックエンドを取り付け、海にカニューレを挿入するために解剖室の中にその先端を配置するマイクロマニピュレータにマイクロピペットを固定します。 赤血球のすべてが洗い流されると、カニューレ挿入ピペットから海に削除し、解剖皿の外にピペットを持ち上げます。 小さなセグメントにそれぞれ長さ1〜3ミリメートルを海に切る。これらの短いセグメントは、内皮管の単離を容易にする。 4。内皮チューブの分離 12ミリメートル×75ミリメートルガラスカルトを埋める氷冷たい解剖バッファーでUREチューブを半押しします。角度のついた鉗子を使用して、氷の上で培養管、所定の位置に動脈部分を転送します。このとき、別々の12ミリメートル×75 mm培養チューブ内の1mLの最終容量に解離緩衝液を用いた消化酵素を組み合わせる（1.3.2ソリューションを参照）および加熱ブロックで37℃に溶液を予熱する。 解離緩衝液および酵素を暖機している間、慎重に血管セグメントを含む小さな容積を残して培養管から解離緩衝液を吸引する。 静かに残りの解剖バッファを洗い流すために酵素を含まない室温解離緩衝液を追加します。ヒント：動脈片は彼らが定住するのを待つ時間を節約するために培養管の底に残っていることを徐々にこのような解離緩衝液を追加します。衝撃を最小化するために37℃、室温（〜24℃）に、氷（4℃）からの複数の段階にわたってバッファ温度を上げる。 慎重にdissocを吸引培養管からiationバッファ、再び血管セグメントを含む小さなボリュームを残してくださいという。 加熱ブロックからの酵素で予熱解離緩衝液を除去血管セグメントを含む培養チューブに酵素溶液1mlを転送し、加熱ブロックに戻し培養管を配置。 30分間37℃でインキュベートする。 酵素とのインキュベーション中、チュレーションピペットを準備し、ミネラルオイルでそれを埋め戻すとマイクロマニピュレータに装着されているマイクロシリンジの上に固定します。その後、解離緩衝液の2 NLでピペットを記入し、フローチャンバーの上にピペットチップを配置するマイクロシリンジのプランジャーを引き込む。 30分間のインキュベーションの終わりに、加熱ブロックから培養管を取り外して慎重に上記緩衝液を吸引する。 室温解離緩衝液4mlで動脈セグメントを洗浄します。注意：これは、血管のSEGMを維持する必要がなくなりまし培養管の下部にあるエント、動脈片を乱す、実際には、残留酵素が効果的に除去されていることを確認するのに役立ちます。 穏やかを1mlマイクロピペットでそれを吸引し、解離緩衝液1mlでフローチャンバー内に置くことにより、フローチャンバへの移送つの容器セグメント。 マイクロシリンジを含むマイクロマニピュレータを利用して、血管セグメントの一方の端の近くでチュレーションピペットの先端に配置します。 のECへの機械的な歪みを引き起こし、その後、バックチャンバーにそれを排出しないように、粉砕するピペットにゆっくりと（225 NL /秒）に血管部分（撤回500 nl）を吸引除去する。消化が成功した場合は、平滑筋細胞および外膜、内皮管から解離する。 すべての平滑筋細胞が解離するまでチュレーションを繰り返します。過度チュレーション（4X以上）のECを損傷し、アゴニストにそれらが応答しなくなる可能性があることに注意してください。ヒント：チュレーションピペットを用いて、チューブを交絡からそれを維持するために、できるだけ早く離れて内皮管から外膜を移動します。注：摩ピペットを用いて、単離された内皮チューブを吸引し、別々のチャンバーに移すことができる。 、フローチャンバーの中心に内皮チューブを配置し、流れの方向に沿って整列し、粉砕するピペットを削除します。 マイクロマニピュレータにおけるセキュアなピニングピペットは、フローチャンバーの両端に取り付けられており、内皮管の両端にそれらの先端を配置します。 チャンバーの底に対してそれを押すようにチューブの一端を介してピニングピペットを下げます。チューブの反対側の端に同じ方法で、第二のピニングピペットを置きます。注意：ピン止めピペットの配置は、トレードオフ（チューブ端から遠くに置くこと）および複数の撮像/実験エリアを可能に（近い管の端にそれらを置くこと）チューブを固定しての間にある。 Tの場所チューブの各端から裾〜50程度が適しています。ピニングピペット、チューブに接触したのと同じように、ゆっくりと、それによってin vivoでの長さに近づけるために、それを拡張し、チューブの軸に沿って、それを撤回してから、チューブを固定するために、チャンバ底部にピペットを押してください。 灌流液の流れを開始し、（ 図3C参照 ）内皮チューブを平衡化して付着させ、少なくとも20分間休ませることができます。内皮チューブで一定の流体流（灌流）を維持するために、蠕動ポンプを使用しています。注：内皮管はフローチャンバーの底部（〜25分）に付着または内皮チューブが取り外されたとならない保証するために適所に残された後ピニングピペットで除去することができる。 5。色素負荷およびカルシウムイメージング細胞内カルシウム応答を可視室温でのfluo-4 AM色素で内皮チューブをロードする（〜24℃）。槽内の流体の流れを停止し、フルオ4を追加10μMの最終濃度でチャンバに思います。その後、細胞外の染料を除去し、細胞内の色素が完全に脱エステル化されていることで確認するために20分間、新鮮な、PSSと内皮チューブを表面かん流する、色素が細胞に入ることができるように10分待ちます。 カルシウムイメージングを行う。この作業のために、正立顕微鏡はスピニングディスク共焦点イメージングシステムを備えた周囲の室温で使用した（ 図2参照 ）。 491 nmのレーザーを蛍光カルシウム色素を励起し、激化デジタルカメラを使用して（500〜550 nmの発光で）画像を取得する。