בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

1. הכנת הציוד: תזרים הלשכה, טפטפות, ופתרונות תא זרימה: השתמש בתא זרימה עם coverslip זכוכית x 50 מ"מ 24 מ"מ בתחתית לsuperfuse צינורות המבודדים אנדותל (ראו איור 1 א). לפני ההרכבה הקאמרית, לשטוף coverslips הזכוכית עם שני 3% HCl ו70% אתנול, לשטוף עם מים ultrapure, ויבש עם גז חנקן. טפטפות: שלושה סוגים שונים של טפטפות משמשות במהלך הפרוטוקול: cannulation, טחינה דקה, ומצמיד. שני cannulation וטפטפות תולה יכולים להתבצע לפני יום הניסוי, אך טפטפת טחינה דקה צריכים להיעשות ביום כפי שהוא דורש ידע בקוטר של כלי לגודל לומן כראוי. טפטפות cannulation: על מנת לשטוף את תאי דם אדומים מהלום, למשוך צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט באמצעות חולץ micropipette יש קצוות ארוכים, מחודדים. לשבור את הקצוות עם מלקחיים לקוטר חיצוני ~ 30% less מזה של העורקים (~ 50-80 מיקרומטר), ופולני אש הקצה להיות חלק (ראה איור 1). זה מועיל לזווית גם הטיפים של טפטפות ל45 כ °. טפטפות טחינה דקה: כדי לנתק באופן מכאני את תאי שריר החלק וadventitia מצינורות אנדותל, להפוך טפטפות triturating מצינורות זכוכית נימי ורוסיליקט. הכן את צינורות נימים כאמור לעיל, ולשבור את הקצה עם מלקחיים. טיפ: השתמש במכשיר ניקוד זכוכית כדי שיהיה קל יותר לשבור את הקיר העבה של זכוכית פיפטה טחינה דקה בצורה נקיה. לשבור את פיפטה לקוטר הפנימי שנקבע ביום של הניסוי, כ 10-20 מיקרומטר הגדול יותר מזה של הקוטר החיצוני של כלי השיט שממנו הצינורות אנדותל יהיו מבודדים. פולני אש הקצוות שבורים עד שהתערובת חלקה (ראה תרשים 1C). מצמיד טפטפות: כדי לייצב את צינור אנדותל בתוך תא הזרימה, להפוך מצמיד טפטפות כדי לאבטח את t אנדותלאופה נגד תחתית coverslip של החדר. משוך צינורות זכוכית נימים באופן זהה טפטפות cannulation. ואז לשבור את הקצוות עם מלקחיים לקוטר של ~ 100 מיקרומטר, ופולני אש עד שהקצוות נסגרים, מעוגל וחלק (ראה איור 1D). הערה: אם הקצה של פיפטה מצמיד אינו אטום לחלוטין, נוזל ייכנס ללום ועלולה לבלבל את תוצאות ניסוי. פתרונות: הכן את כל הפתרונות בultrapure (18.2 MΩ) H 2 O ולעקר אותם דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. ודא osmolality של הפתרונות הוא בין 285-300 mOsm. פתרונות יישארו טובים במשך כשבועיים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. פתרון לנתיחה: תמיסת מלח בשימוש במהלך הניתוח של העורק ברום הבטן מעולה מורכבת (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה ( HEPES), 10 גלוקוז, נתרן ניתרופרוסיד 0.01 (SNP),ד 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA) עם pH של 7.4. SNP תורם NO כלול כדי לעזור להירגע תאי שריר חלק, ובכך הופך אותם קלה יותר לcannulate העורק וכדי להקל על ההסרה של תאי שריר חלק בטחינה דקה. פתרון דיסוציאציה: תמיסת מלח משמשת במהלך הניתוק של צינור אנדותל מורכב (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 2 CaCl 2, וארגון ה-BSA 0.1%, עם ה-pH של 7.4. לaliquot 1 מיליליטר של החיץ הזה, להוסיף: פפאין 0.62 מ"ג / מיליליטר, 1.5 מ"ג / מיליליטר collagenase ו1.0 מ"ג / מיליליטר dithioerythritol. מאז אנזימים מהספקים שונים יכולים להיות ברמות שונות של פעילות האנזימטית, מספרי המוצר של אלה המשמשים לעבודה זו כלולים לעיון בטבלה של חומרים. הערה: במהלך הפרוטוקול שני דיסוציאציה חיץ וחיץ ניתוק עם אנזימים המשמשים בשלבים שונים. פתרון superfusion: הפתרון הפיזיולוגי מלח (PSS) המשמש לsuperfusing צינור אנדותל המבודד מורכב (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז ו2 CaCl 2, עם pH של 7.4. הכן את המאגרים ופתרונות לפני תחילת הליכים כירורגיים. הסר את הפתרונות מ4 ° C ו aliquot 50 מיליליטר של חיץ Dissection לתוך בקבוק 200 מיליליטר Erlenmeyer ולמקם אותו על קרח. בנוסף, aliquot 50 מיליליטר של דיסוציאציה חיץ ללא אנזימים ולמקם אותו על גבי הספסל כדי לאזן לטמפרטורת חדר. הסר את פתרון superfusion מ4 ° C ולאפשר לו לאזן לטמפרטורת חדר על גבי הספסל. 2. הכנת בעלי החיים לוודא שכל הנהלים והפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים הם בקנה אחד עם המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטהמיזורי. השתמש בזכר או נקבות עכברים לפחות 9 שבועות וללמוד כל אחד בנפרד. הרדימי עכבר עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם) באמצעות intraperitoneal הזרקה (IP). טיפ: דילול pentobarbital ל10 מ"ג / מיליליטר בתמיסת מלח סטרילית לפני ההזרקה מקטינה את האפשרות של מנת יתר. הרדמה פשרות ויסות טמפרטורה, כדי לשמור על העכבר לחמם מייד לאחר הזריקה הראשונה של pentobarbital. שימוש במנשא מתכת (סל אלומיניום מאוורר) על גבי צלחת חימום (מכוילת ל~ 37 מעלות צלזיוס) עובד היטב כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר יציב. לחלופין, השתמש במנורת חום, מטפלת כדי למקם אותו במרחק מתאים מהעכבר. לפקח על העכבר בכל דקות 5-10 עד הרמה המתאימה של הרדמה מושגת (חוסר הנסיגה לבוהן או קמצוץ זנב). מינון משלים עשוי להידרש לאחר 15-20 דקות. עדיף להתקדם לאט ובזהירות, כדי למנוע מינון יתר, במיוחד עם השמנת יתר, גיל, או בעלי חייםs הדגיש אחרת. להסיר את השיער מהצד הגחון על ידי גילוחו בזהירות עם קוצץ שיער חיות מחמד קטן. יש לנקוט בתשומת לב מיוחדת, כדי למנוע טראומה לבעלי החיים. זה מועיל כדי להסיר את כל השיער מאזור המשתרע בתי השחי לאזור הערווה. הסר את כל שיער באופן רופף דבקות עם ספוגית אלכוהול טרי. מקם את העכבר על גבה, שוכב עם שני קדמיים והאחוריים גפיים פרושים לחשוף כמה שיותר את דופן הבטן ככל האפשר. במידת צורך, להשתמש בקלטת מעבדה כדי לאבטח את הרגליים באופן התפשטות נשר. 3. בידוד של עורקי Superior ברום הבטן לעשות חתך קטן דרך העור בדיוק מעל האזור של אזור הערווה. להבטיח שרק העור נחתך תוך הימנעות נזק לשרירי הבטן הבסיסיים; להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון אל hindlimbs בהתאמה. המשך את החתך rostrally לאורך קו האמצע הגחון לחלק העליון של כלוב הצלעות וn להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון לforelimbs בהתאמה. רם בעדינות את העור ולהשתמש במספריים כדי לנתק את רקמות חיבור המחזיקות את העור לשריר הבסיסי, ובכך לחשוף את כל פני השטח של שרירי הבטן (ראו איור 3 א). להשקות את השריר החשוף עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. בשל גודלו הקטן של הים, מקם את החיה מתחת סטראו להליכים נוספים. הרם את כרית השומן ממוקמת בחלק התחתון של עצם החזה עם מלקחיים, ועושה חתך דרכו. המשך החתך לאורך הצלעות התחתונה, כדי לוודא שלא לחתוך עמוק מדי לתוך הרקמה הבסיסית. הים צריך להיות גלוי; לטפל כדי למנוע פגיעה בו. לאחר החתך הוא מלא, להשקות את הרקמה חשופה עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. לאחר השכבה העליונה של שריר שלד כבר חזר בו, בים ובשרירים שבבסיסם מזוהים בקלות. טיפ: שים לב לאורכו שלSEA in vivo לפני שהבודד להאריך צינורות אנדותל (אשר לקצר לאורך הציר שלהם על בידוד) משוער האורך המקורי שלהם. בעזרת מלקחיים ומספריים, בלו, בזהירות שכבת השריר דקה מתחת לים. בעזרת מלקחיים זוויתי, עובר באורך של 6-0 תפר משי מתחת לים ולקשור את העורק ווריד הסמוכים לה כדי לשמור עליה בלחץ דם ונשמר בתוך לומן הכלי כדי להקל על הדמיה בבידוד וניקוי שלאחר מכן. חזור על תהליך קשירת SEA בצד הנגדי. לאחר שני הימים כבר את הגבעול, עושה חתך לאורך קו האמצע של שרירי בטן על מנת להפריד בין צדדים, בהתאמה. להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון כפי שנעשה לעור, ולאחר מכן להמשיך את החתך אנכי לאורך הקצה החיצוני כדי להפריד לחלוטין את שריר הבטן מהגוף. למנוע נזק לכלי הדם ניזון הים כדי לשמור על לומן בלחץ. Cut הים מעל לקשירה כדי לשמור על החותם, ולמקם את השריר ועורק הבודדים בכוס 50 מיליליטר מכילה 10 מיליליטר של 4 ° C חיץ לנתיחה. חזור על התהליך עבור הצד של הבטן האחר ודגירת הרקמות בחיץ לנתיחה עבור 10 דקות. הנח את השרירים בטן המכילים את הים בחיץ נתיחה מצונן (4 מעלות צלזיוס) חדר נתיחה המכיל (ראה איור 3 ב). חדר הנתיחה מורכב מצלחת פטרי עם שכבה של Sylgard (polydimethylsiloxane [PDMS]) בתחתית. באמצעות סיכות חרקים (0.15 מ"מ), למתוח את הים המבודד ושרירי בטן משוער in vivo אורכים (שצוין לעיל) ולאבטח אותו לSylgard. טיפ: המכוון לשריר כך שהשכבה דקה מול הצפק היא על גבי הופך את הים לעין בקלות באמצעות שקוף. תוך שימוש בכלי microdissection בסדר ועובד מהאתר במעלה הזרם של קשירה כלפיסוף במורד הזרם, לנקות את הים מהווריד לזווגה והרקמה הסובבת עד האתר הגדול הראשון של הסניף (1-2 סנטימטר). ואז תחתוך את הים על ידי חיתוך זה פשוט מעל אתר הסניף וממש מתחת לקשירה. כדי להסיר דם נשמרים בתוך לומן הכלי, cannulate הים ולשטוף אותו עם חיץ לנתיחה קרה כקרח. באמצעות פיסת צינורות silastic, לצרף את הקצה האחורי של פיפטה cannulation למזרק 5 מיליליטר המכיל חיץ לנתיחה קר כקרח ולאבטח את micropipette בmicromanipulator למצב את קצהו בתוך חדר הנתיחה כדי cannulate הים. ברגע שכל אריתרוציטים הם סמוקים החוצה, להסיר את הים מפיפטה cannulation, והרם את פיפטה מהצלחת לנתיחה. חותכים את הים למקטעים קטנים יותר כל מ"מ 1-3 באורך. קטעים קצרים אלה להקל על הבידוד של צינורות אנדותל. 4. בידוד של צינור האנדותל מלא כת זכוכית x 75 מ"מ 12באמצע הדרך צינור יור עם חיץ לנתיחה קר כקרח. בעזרת מלקחיים זוויתי, להעביר את חלקי עורקים לתוך צינור התרבות ומניח על קרח. בשלב זה, לשלב את אנזימי עיכול עם חיץ דיסוציאציה לנפח סופי של 1 מיליליטר בצינור תרבות 12 מ"מ x 75 מ"מ נפרד (ראה 1.3.2 פתרונות) ומחמם את הפתרון ל37 ° C עם בלוק חימום. בעוד חיץ הניתוק והאנזימים מתחממים, לשאוב בזהירות את חיץ הנתיחה מצינור התרבות משאיר נפח קטן המכיל את קטעי כלי השיט. בעדינות להוסיף חיץ ניתוק טמפרטורת חדר ללא אנזימים כדי לשטוף חיץ נתיחה שנותר. טיפ: הוסף את חיץ הניתוק כזה לאט שחתיכות עורקים יישארו בחלק התחתון של צינור התרבות כדי לחסוך זמן מחכה להם להתיישב מחדש. להעלות את טמפרטורות החיץ לאורך שלבים מרובים מקרח (4 מעלות צלזיוס), לטמפרטורת חדר (~ 24 מעלות צלזיוס), ל37 ° C כדי למזער את ההלם. לשאוב dissoc זהירותiation חיץ מצינור התרבות, שוב להיות בטוח להשאיר את נפח קטן המכיל את קטעי כלי השיט. הסר את חיץ ניתוק החימום המוקדם עם אנזימים מבלוק החימום, להעביר 1 מיליליטר של תמיסת אנזים לצינור התרבות המכיל מקטעי הכלי, והנח את צינור התרבות אחורה בבלוק החימום. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה עם אנזימים, להכין את פיפטה טחינה דקה, לגבות אותו עם שמן מינרלים ולאבטח אותו על microsyringe כי הוא רכוב בmicromanipulator. ואז לחזור על בוכנת microsyringe למלא את פיפטה עם 2 NL של חיץ ניתוק ולמקם את קצה פיפטה מעל תא הזרימה. בסוף הדגירה 30 דקות, להסיר את צינור התרבות מבלוק החימום ובזהירות לשאוב את החיץ כאמור לעיל. שטוף את מקטעי עורקים עם 4 מיליליטר של חיץ ניתוק טמפרטורת חדר. שים לב: זה כבר לא נחוץ כדי לשמור על segm הכליהמציג בחלק התחתון של צינור התרבות; מפריע חתיכות עורקים ממש עוזר להבטיח כי אנזימי השייר הוסרו באופן יעיל. העברת קטע כלי אחד לתא הזרימה בעדינות על ידי נשיפתו עם micropipette 1 מיליליטר, ולמקם אותו לתוך תא הזרימה עם 1 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה. ניצול micromanipulator מכיל microsyringe, מקם את קצה פיפטה טחינה דקה ליד קצה אחד של מגזר כלי השיט. לשאוב מגזר הכלי (500 NL נסוג) לתוך פיפטה triturating לאט (225 NL / sec), כדי שלא לגרום למתח מכאני לECS, ולאחר מכן להוציא אותו בחזרה לתוך החדר. אם העיכול היה מוצלח, תאי שריר החלק וadventitia יהיו מנותקים מצינור אנדותל. חזור על טחינה דקה עד שכל תאי שריר החלק הם ניתקו. להיות מודע לכך שטחינה דקה מוגזמת (4x או יותר) עלולה לגרום נזק לECS ו לדקלם אותם מגיבים לאגוניסטים. טיפ:באמצעות פיפטה טחינה דקה, הזז את adventitia מן הצינור אנדותל בהקדם האפשרי כדי למנוע ממנו לסבך את הצינור. הערה: שימוש בפיפטה טחינה דקה, צינור אנדותל המבודד יכול להישאף והועבר לחדר נפרד. מקם את צינור אנדותל במרכז תא הזרימה, מיושר לאורך כיוון הזרימה, ולהסיר את פיפטה triturating. טפטפות מצמיד מאובטחת בmicromanipulators רכוב בכל צד של תא הזרימה, ולמקם את הטיפים שלהם בקצוות בהתאמה של צינור אנדותל. מנמיכים פיפטה תולה על קצה אחד של השפופרת ללחוץ עליו מפני החלק התחתון של החדר. מקם את פיפטה המצמיד השנייה באותה הדרך בקצה השני של הצינור. הערה: מיקום של טפטפות הנעיצה הוא trade-off בין אבטחת הצינור (למקם אותם רחוק יותר מהקצה של הצינור) ומאפשר ליותר הדמיה / אזור ניסוי (למקם אותם יותר קרוב לקצה של הצינור). איתור tשולי ~ 50 מיקרומטר מכל קצה של הצינור עובד היטב. בדיוק כמו פיפטה מצמיד נוגעת בצינור, לחזור בו לאיטו לאורך הציר של הצינור, ובכך להאריך אותו כדי להתקרב in vivo אורך; לאחר מכן לחץ על פיפטה אל תחתית החדר כדי להבטיח את הצינור. תתחיל הזרימה של פתרון superfusion, ולאפשר את צינור אנדותל לנוח לפחות 20 דקות כדי לאזן ולדבוק (ראה איור 3 ג). לנצל משאבת peristaltic כדי לשמור על זרימה מתמדת נוזל (superfusion) על פני צינור אנדותל. הערה: טפטפות הצמדה ניתן להסיר ברגע שצינור אנדותל דבק בחלק התחתון של תא הזרימה (~ 25 דקות) או נשאר במקומו, כדי להבטיח את צינור אנדותל אינו הופך שנעקר. 5. טעינת צבע וסידן הדמיה כדי להמחיש את תגובות סידן תוך תאי, טען את צינור אנדותל עם fluo-4 צבע AM בטמפרטורת חדר (~ 24 מעלות צלזיוס). לעצור את זרימת נוזל באמבטיה, ולהוסיף fluo-4בבוקר לתא בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. המתן 10 דקות כדי לאפשר לצבע לחדור לתאים, ולאחר מכן superfuse צינור אנדותל עם PSS הטרי עבור 20 דקות כדי להבטיח צבע תאי מוסר ושהצבע תאיים כבר מלא דה esterified. לבצע הדמיה סידן. לעבודה זו, מיקרוסקופ זקוף (ראה תרשים 2) מצויד במערכת הדמיה confocal דיסק מסתובב שימש בטמפרטורת חדר הסביבה. Excite צבע סיד הניאון עם לייזר 491 ננומטר ולרכוש תמונות (ב500-550 פליטת ננומטר) באמצעות מצלמה דיגיטלית התעצמה.