Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em> Burkholderia</em> Türler

Genus Burkholderia fazla 62 türü, niş geniş bir izole edilen Gram negatif organizmaları içerir ve iki ana küme ^1,2 ayrılmıştır. İlk küme insan, hayvan ve phytotrophic organizmaları içerir ve en çok çalışmalar nedeniyle klinik önemi bu grubun patojenik türler odaklanmıştır. En patojen üyeleri B'dir pseudomallei ve B. (sırasıyla Meliodosis ve ruam neden olur) mallei ^3,4 ve kistik fibrozis (CF) ve kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) hastalığa neden fırsatçı patojenler ⁵ (Burkholderia cepacia'nın kompleksi, BCC 17 tanımlanmış türler), ^1. 30'dan fazla patojenik türlerle ikinci küme, bitkiler ya da ortamı ile ilişkili bakteri içerir ve ana ² için potansiyel olarak yararlı olarak kabul edilmektedir.

Çok sayıda komplikasyonlar ortaya frBu tür durumlarda, çünkü ^6-9 çoğunda ortadan kaldırmak için zor hale antibiyotiklere karşı içsel veya kazanılmış direnç hasta, hastalığın yayılmasını ve tedavi başarısızlık arasındaki patojenin iletimi gibi Burkholderia cinsin patojenik üyeleri ile om bakteriyel enfeksiyon. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyon kurulması için esas daha net bir anlayış kazanıyor bu organizmaların neden olduğu hastalıkların tedavisi için çok önemlidir. Enfeksiyon kurulması anlamak amacıyla, patogenez ile ilişkili bakteri bileşenleri üzerinde kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Proteomik yaklaşımlar kullanılarak Burkholderia organizmaların proteomik analizi odaklanan çalışmalar bakteri patojeninde yanı sıra proteomu değişiklikler ^10-16 profilleri edilmiş proteinler açıklanmıştır.

Yüksek konsantre ihtiva eden liziz tamponu içinde sonikasyon ve dondurularak çözülmüş döngüleri kullanılarak protein çıkarma yöntemleriüre entration, deterjan ve amfolitler ile kombinasyon halinde tioüre Burkholderia proteomik çalışmalar ^10-13 uygulanmıştır. Üre protein denatürasyonu için oldukça etkili olsa da, bu şekilde (Karbamilleme reaksiyonu) ¹⁷ eserler oluşturan amino asit grupları ile reaksiyona girebilen amonyum izosiyanat, sulu çözelti içinde bir denge kurabilir. Bu nedenle, siyanat tarayıcılar olarak işlev taşıyıcı amfolitler içerir ve 37 ° C ¹⁷ üzerinde sıcaklıklar önlemek için önerilir. Ayrıca, protein miktarının eden liziz tamponu, herhangi bir kimyasal etkileşimi önlemek için, aynı liziz tamponu örnekler ve standartlar, aynı arka plan ¹⁰ sahiptir, böylece standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir. Diğer yöntemler ısı kuluçka dönemleri ^17,18 ile alkalin tamponlar ve deterjan kullanımını içerir, ancak bu koşulların proteomun değişikliklere neden olabilir ve bazı deterjanlar pr ile uyumlu değildiroteomics uygulama müteakip deterjan kaldırma adımlar ^17,18 dahil edilmedikçe.

, Yeterli bir özümleme ve miktar sonra her bir proteinin küresel protein ekspresyonu, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi gibi proteomik yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Bu teknik, ilk olarak O'Farell ¹⁹ tarafından tanımlanan ve ikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve daha sonra, moleküler ağırlığa göre de oluşuyor. Nedeniyle çözünürlük ve hassasiyet için, bu teknik karmaşık biyolojik kaynaklardan ^19,20 proteinlerin analizi ve tespiti için güçlü bir araçtır. Bu ayırma tekniği transkripsiyon sonrası modifikasyon veya proteolitik işlenmesi nedeniyle protein izoformlarını çözme büyük avantajı ile protein-merkezli yaklaşımlar şu anda kullanılabilir. Kantitatif değişikliklerJelin ²⁰ lekelenmesiyle karşılık gelen nokta yoğunluğunu karşılaştırarak tespit edilebilir. Ancak, bu teknik çok büyük proteinler, zar proteinleri, oldukça bazik ve asidik ya da hidrofobik proteinlerin tanımlanması için uygun ve biraz zahmetli ve zaman alıcı bir teknik ^20'dir değildir. Daha sağlam ve objektif olan yeni peptid-merkezli yaklaşımlar (non jel bazlı) kullanılabilir hale gelir ve bu (İcat) ²¹ etiketleme izotop kodlu afinite ile sistein etiketleme, ve amino grubu gibi diferansiyel izotop etiketleme yöntemleri ile Kantitatif karşılaştırma için kullanılabilir göreli ve mutlak kantitatif (iTRAQ) ²² için izotop etiketleme tarafından etiketleme. Tek proteomik tekniğin kullanılması yeterli bilgi verebilir ve bu nedenle, iki tamamlayıcı proteomik yaklaşımların kullanımı proteom en tam değerlendirmek değişiklikler için gereklidir. Bununla birlikte, 2-D jel elektroforezi yaygın olarak kullanılan ve rutin Quan için uygulanabilirfarklı organizmalar çeşitli proteinlerin ifadesini titative.

Burada adapte ve optimize GE Healthcare 2-D Elektroforez Esaslarına ve yöntemleri Handbook 80-6429-60AC 2004 (edildi Burkholderia türler için bir bütün hücre protein çıkarma ve 2-D jel elektroforezi prosedürlerini tarif www.amershambiosciences.com ). Protein ekstre etme, 5 mM EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) ve 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florür) içeren PBS varlığında, cam boncuklar ile bir boncuk çırpıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu işlem en az bozulma ile proteinlerin ölçümü sağlar ve daha önce bildirilen ^15,23,24 gibi proteomik yaklaşımlar için iyileştirilebilir. 2-D jel elektroforezi 24 cm uzun hareketsiz pH 4-7 gradyan ve proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi izoelektrik noktasına göre ayrıldı. Sonra proteinler Molec göre ayrıldıSDS-poliakrilamid jel ile küler ağırlığı. Ayrıca, nokta proteinlerin görselleştirme ve kütle spektrometre analizi için uygun olan bir gümüş leke yöntemi için bir gümüş boyama yöntemi açıklanmıştır. Birlikte bu işlemler patojeneze dahil olabilir Burkholderia türlerinin önemli proteinlerin tanımlanmasını izin verebilirsiniz.