Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы<em> Burkholderia</em> Вид

Род Burkholderia содержит более 62 видов, грамотрицательных организмов, выделенные из широкого спектра ниши, и он разделен на две основные группы ^1,2. Первый кластер включает в себя людей, животных и фитотрофных организмов, и большинство исследований были сосредоточены на патогенные видов этой группы в связи с их клиническое значение. Наиболее патогенные члены Б. pseudomallei и В. mallei (который вызывает Melioidosis и сапа соответственно) ^3,4 и условно-патогенных микроорганизмов (в 17 определенных видов cepacia комплекса Burkholderia, BCC) ^5, которые вызывают заболевания у Муковисцидоз (МВ) и ХГБ (КГД) ^1. Второй кластер, с более чем 30 непатогенных видов, включает в себя бактерии, связанные с растениями или с окружающей средой, и считаются потенциально выгоден для хозяина ^2.

Многочисленные осложнения возникают фром бактериальной инфекции с патогенными членов рода Burkholderia, таких как передача возбудителя между пациентами, распространением болезни и неудачи лечения из-за внутренней или приобретенной устойчивости к антибиотикам, делающих трудно искоренить в большинстве случаев ^6-9. Поэтому, приобретая более ясное понимание основы для установления бактериальной инфекции является жизненно важным для лечения заболеваний, вызванных этими организмами. Для того чтобы получить представление о создании инфекции, обширные исследования по бактериальных компонентов, связанных с патогенезом необходимы. Исследования, посвященные протеомного анализа Burkholderia организмов с помощью протеомных подходов описаны белки, которые были вовлечены в бактериальной патогенеза, а также изменения в их протеома профилей ^10-16.

Методы экстракции белка с использованием ультразвука и сублимационной талой циклов в буфере для лизиса, содержащего высокую концentration мочевины, тиомочевины в сочетании с моющим средством и амфолитов был применен в Burkholderia протеомных исследований ^10-13. Хотя мочевина является достаточно эффективным для денатурации белка, он может установить равновесие в водном растворе с изоцианатом аммония, которые могут реагировать с аминогруппами кислота, образуя тем самым артефакты (карбамоилирование реакция) ^17. Поэтому рекомендуется включать носителей амфолитов, которые действуют как цианатных мусорщиков и избежать температур выше 37 ° С ^17. Кроме того, чтобы предотвратить любую химическую вмешательства лизирующего буфера с белком количественного, так же буфере для лизиса может быть использован для создания стандартной кривой так, что образцы и стандарты имеют одинаковую фона ^10. Другие методологии предусматривают использование щелочных буферов и моющих средств с тепловыми инкубационного периода ^17,18, однако эти условия могут вызвать изменения в протеома и некоторые моющие средства не совместимы с пр.oteomics приложение, если последующие шаги по удалению моющего средства не включены ^17,18.

После надлежащей экстракции и количественное, глобальное экспрессии белка каждого отдельного белка могут быть изучены с помощью протеомических подходов, таких как гель-электрофореза двумерной (2-D). Этот метод был впервые описан O'Farell ¹⁹ и состоит в разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точке методом изоэлектрофокусировки в первом измерении, а затем в соответствии с их молекулярной массы акриламида гель-электрофореза во втором измерении. Благодаря своей разрешением и чувствительностью, этот метод является мощным инструментом для анализа и выявления белков из сложных биологических источников ^19,20. Этот метод разделения в настоящее время доступна в белково-ориентированных подходов с большим преимуществом разрешения изоформы белка, вызванные посттранскрипционных модификаций или протеолитической обработки. Количественные изменениямогут быть обнаружены путем сравнения интенсивности соответствующего месте после окрашивания геля ^20. Однако этот способ не подходит для идентификации очень больших белков, мембранных белков, крайне основных и кислотных или гидрофобных белков, и несколько трудоемкий и требует много времени техника ^20. Новые пептидные ориентированные подходы (не гель на основе), которые являются более прочными и цель становятся доступными и могут быть использованы для количественного сравнения по дифференциальных методов стабильных изотопов маркировки, таких как цистеин маркировки с помощью изотопов кодированием сродством мечения (ICAT) ²¹ и аминогруппы маркировка изотопом тегов для относительной и абсолютной количественного (iTRAQ) ^22. Использование одного протеомики техники может дать достаточной информации, поэтому использование двух дополнительных протеомических подходов является необходимым для большинства полностью оценки изменений в протеоме. Тем не менее, гель-электрофорез 2-D широко используется и может быть обычно применяется для квантовойвенных экспрессию нескольких белков в разных организмов.

Здесь мы опишем экстрагирования белка цельноклеточная и 2-D процедуры гель-электрофореза для видов Burkholderia, которые были адаптированы и оптимизированы от GE Healthcare 2-D электрофореза Принципы и методы Руководство 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Экстракцию белка проводили с использованием шарик било со стеклянными шариками в присутствии PBS, содержащего 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид). Эта процедура позволяет количественно оценить белков с минимальными искажениями и исправимо для протеомных подходов как сообщалось ранее ^15,23,24. Гель-электрофорез 2-D проводили с использованием 24 см в длину, иммобилизованных рН 4-7 градиента и белки были разделены в соответствии с их изоэлектрической точке. Затем белки были разделены в соответствии с их Molecулар вес на SDS-полиакриламидном геле. Кроме того, мы описали метод окраски серебром для визуализации спот белков, и серебряным методом окраски, совместимый для масс-спектрометрического анализа. Вместе эти процедуры могут позволить идентификацию важных белков из видов Burkholderia, которые могут быть вовлечены в патогенез.