Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em> Burkholderia</em> Arten

Die Gattung Burkholderia umfasst mehr als 62 Arten, Gram-negative Organismen aus einer Vielzahl von Nischen isoliert, und es ist in zwei Hauptcluster ^1,2 unterteilt ist. Der erste Cluster umfasst menschliche, tierische und phytotrophic Organismen, und die meisten Studien haben sich auf die pathogenen Arten dieser Gruppe aufgrund ihrer klinischen Bedeutung konzentriert. Die meisten Mitglieder sind pathogene B. pseudomallei und B. mallei (die Melioidose Rotz und bewirkt, dass jeweils) ^3,4 und opportunistische Infektionen (die 17 Arten der Burkholderia cepacia-Komplex, BCC) ^5, die Krankheit bei zystischer Fibrose (CF) und chronische Granulomatose (CGD) führen ^ein. Der zweite Cluster mit mehr als 30 nicht-pathogenen Spezies enthält Bakterien mit Pflanzen oder mit der Umgebung verbunden und werden als potentiell nützlich, um den ^Host-2.

Zahlreiche Komplikationen entstehen from bakterielle Infektion mit dem pathogenen Mitgliedern der Gattung Burkholderia, wie die Übertragung des Erregers zwischen Patienten, Ausbreitung der Krankheit und Therapieversagen wegen der intrinsischen oder erworbene Resistenz gegenüber Antibiotika schwer zu machen in den meisten Fällen ^6-9 beseitigen. Daher gewinnt ein besseres Verständnis der Grundlagen zur Erstellung von bakteriellen Infektion ist entscheidend für die Behandlung von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Um Einblick in die Etablierung der Infektion zu gewinnen, sind umfangreiche Untersuchungen der bakteriellen Komponenten mit Pathogenese verbunden nötig. Studien mit Schwerpunkt auf der Proteom-Analyse von Burkholderia Organismen unter Verwendung Proteom-Ansätzen beschriebenen Proteine, die in bakteriellen Pathogenese impliziert worden sind sowie Veränderungen in ihrem Proteom-Profile ^10-16.

Protein-Extraktionsverfahren mit Ultraschall und gefrieraufgetaut Zyklen in Lyse-Puffer mit hoher konzentration Harnstoff, Thioharnstoff ist in Kombination mit Reinigungsmittel und Ampholyte in Burkholderia proteomische Studien ^10-13 angewendet. Obwohl Harnstoff ist sehr effizient für die Denaturierung von Proteinen, kann es ein Gleichgewicht in wässriger Lösung mit Ammonium Isocyanat, die mit Amino-Gruppen reagieren können, zu schaffen, wodurch Artefakte (Carbamylierung Reaktion) ^17. Daher ist es empfehlenswert, Trägerampholyten, die als Radikalfänger wirken, umfassen Cyanat und vermeiden Sie Temperaturen über 37 ° C ^17. Weiterhin jede chemische Störungen Lysepuffer mit Proteinquantifizierung zu verhindern, können die gleichen Lyse-Puffer verwendet, um die Standardkurve zu erzeugen, so dass die Proben und die Standards, die gleiche Hintergrund ¹⁰ werden. Andere Methoden beinhalten die Verwendung von alkalischen Puffer-und Reinigungsmittel mit Wärme Inkubationszeiten ^17,18, aber diese Bedingungen könnten Veränderungen im Proteom induzieren und einige Reinigungsmittel sind nicht kompatibel mit proteomics Anwendung, es sei denn anschließenden Reinigungsausbauschritte enthalten ^17,18.

Nach ausreichender Extraktion und Quantifizierung können globale Proteinexpression jedes einzelnen Proteins unter Verwendung Proteomics wie zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese untersucht werden. Diese Technik wurde zuerst von O'Farell ¹⁹ beschrieben und besteht in der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, und dann nach ihrem Molekulargewicht durch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Aufgrund der Auflösung und Empfindlichkeit, ist diese Technik ein mächtiges Werkzeug für die Analyse und Detektion von Proteinen aus komplexen biologischen Quellen ^19,20. Dieses Trennverfahren ist in Protein-zentrierte Ansätze mit dem großen Vorteil zur Lösung von Protein-Isoformen durch posttranskriptionelle Modifikationen oder proteolytische Verarbeitung verursacht verfügbar. Quantitative Veränderungenkann durch Vergleich der Intensität des entsprechenden Punkt nach Färbung des Gels ²⁰ detektiert werden. Jedoch ist diese Technik nicht für die Ermittlung von sehr großen Proteine, Membranproteine ​​extrem basischen und sauren oder hydrophoben Proteine ​​geeignet, und ist etwas mühsam und zeitaufwendige Technik ^20. Neue Peptid-zentrierten Ansätzen (nicht Gel-Basis), die robuster und Ziel sind verfügbar und können zur quantitativen Vergleich von Differential stabilen Isotopenmarkierungsmethoden wie Cystein Kennzeichnung von isotopencodierten Affinität Tagging (ICAT) ^21, und Amino-Gruppe verwendet werden Kennzeichnung von Isotop-Tagging für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) ^22. Die Verwendung eines einzigen Proteom Technik könnte nicht genügend Informationen erhalten, so dass die Verwendung von zwei komplementären Proteomics notwendig ist für die meisten vollständig Beurteilung von Veränderungen im Proteom. Dennoch ist 2-D-Gelelektrophorese verbreiteten und routinemäßig für Mengen angewendet werdentive Expression mehrerer Proteine ​​in verschiedenen Organismen.

Hier beschreiben wir eine Ganzzellproteinextraktion und 2-D-Gelelektrophorese Verfahren für Burkholderia Spezies, die angepasst und optimiert wurden aus den GE Healthcare 2-D-Elektrophorese-Grundlagen und Methoden-Handbuch 80-6429 60AC-2004 ( www.amershambiosciences.com ). Die Proteingewinnung wurde mit einer Kugelmühle mit Glasperlen in Gegenwart von PBS mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die Quantifizierung von Proteinen mit minimalen Abbau und änderbare für proteomische Ansätze wie bereits berichtet ^15,23,24. 2-D-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung von 24 cm immobilisierte pH-Gradienten von 4-7 und Proteinen durchgeführt wurden entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt abgetrennt. Proteine ​​wurden dann entsprechend ihrer Mole getrenntdere Gewicht durch SDS-Polyacrylamid-Gel. Außerdem beschrieben wir eine Silberfärbung Verfahren zur Visualisierung von Punkt Proteinen und einer Silberfärbung Methode, die für die Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist. Zusammen können diese Verfahren die Identifizierung von wichtigen Proteinen aus Burkholderia-Arten, die in der Pathogenese beteiligt sein könnten ermöglichen.