Polimer Microspheres ve Fiber-optik Paketler kullanma İnsan Tükürük Protein Analiz için çoklu Floresan Microarray
Summary
Bu multiplekslenmiş mikroküre bazlı antikor dizileri kullanılarak, tükürük proteinlerini profil için bir prosedür tarif eder. Monoklonal antikorlar, kovalent karbodiimid kimyası kullanılarak floresan boya ile kodlanmış 4,5 um polimer mikro bağlanmıştı. Modifiye mikroküreler floresan sandviç immunoassay'ler kullanılarak tükürük protein seviyelerini ölçmek için fiber-optik mikro oyuk birikmiştir.
Abstract
Burada, aynı zamanda, bir fiber-optik mikroküre bazlı antikor dizisi kullanarak tükürük proteinlerini altı ölçmek için bir protokolü tarif eder. Kullanılan immüno-dizi teknolojisi, floresan mikroskobu kullanımı ile mikroküre bazlı süspansiyon dizi üretim avantajlarını bir araya getirmektedir. Video protokolde tarif edildiği gibi, ticari olarak temin edilebilen 4,5 um, polimer mikrosferleri, fiziksel olarak mikro kürelerin içine sıkışıp iki floresan boyaların konsantrasyonu ile ayırt yedi farklı türde kodlanmış edilmiştir. Yüzey karboksil grupları içeren kodlanmış mikro EDC / NHS birleştirme kimyası ile monoklonal antikorlar ile modifiye edilmiştir. Protein mikrodizi monte etmek için, kodlanmış ve işlevselleştirilmiş mikrosferlerinin farklı karıştırılır ve rasgele kimyasal olarak bir fiber optik demetin yakın ucunda dağlanmıştır 4,5 um olan mikro oyuk, yatırılır. Fiber optik demeti, bir taşıyıcı madde ve hem de m görüntülenmesinde kullanılmıştıricrospheres. Monte edildikten sonra, mikrodizi klinik toplanan tükürük yüzer proteinleri yakalamak için kullanıldı. İzleme, bir streptavidin-konjuge floresan prob, R-fikoeritrin farklı analitler için biyotinile edilmiş antikorların algılama oluşan bir karışımı kullanarak, bir sandviç bağışıklık dayanıyordu. Mikrodizi mikroküre kayıt ve değerlendirme sinyali için biri için üç farklı kanal, iki floresan mikroskop ile görüntülendi. Floresan Mikrograflarda sonra çözülür ve MATLAB bir ev yapımı bir algoritma kullanılarak analiz edildi.
Introduction
Mark Schena ve 1990'ların ortalarında arkadaşları tarafından bildirilen ilk mikroarray beri, bu güçlü araç, biyolojik araştırmaların 1. birçok alanda kullanılmıştır. Aynı zamanda, kan gibi teşhis sıvıları, birden fazla proteinleri saptayabilen antikor mikrodizileri, klinik teşhis ve biyolojik tarama 2-10 önemli uygulamaları vardır. Tükürük, kan gibi aynı analitlere birçok içeren, tükürük toplama, güvenli ve noninvaziv çünkü kan bir tercih alternatif olarak kabul edilmiştir, ve minimal-eğitimli tıbbi personel 11-13 tarafından yapılabilir. Şu anda, tükürük numuneleri kullanılarak çoğaltılmış çok katlı protein analiz hedef analitin 14 en düşük konsantrasyonu ve farklı biyolojik 15 arasında geniş bir konsantrasyon aralığı dahil olmak üzere, pek çok önemli faktör tarafından sınırlıdır.
.Burada, altı proteinlerinin analizi gösterilmektedir: insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interferon gama-kaynaklı protein 10 (IP-10), interlökin-8 (IL-8), epidermal büyüme faktörü (EGF), matriks metalopeptidaz 9 (MMP-9), ve interlökin-1 beta (IL-1β) . Yöntemin performansı ilk olarak rekombinant proteinleri analit teşkil eden ve bloke edici tampon standart solüsyonları kullanılarak doğrulandı. Farklı kronik solunum yolu hastalıklarının hasta hem de sağlıklı kontrollerden toplanmış gerçek tükürük numuneleri, aynı zamanda tatmin edici bir performans ile test edilmiştir. Protokol diğer protein analit ve diğer mikroküre bazlı deneylere uygulanabilir olmalıdır. Bir ile karşılaştırıldığında, geniş bir dinamik aralık, en az spesifik olmayan etkileşimleri, daha az örnek tüketimi, ve düşük maliyet ile çeşitli proteinlerin düşük konsantrasyonlarda hızlı, doğru ve tekrarlanabilir bir eş zamanlı olarak analiz sağlar Bu platform, Analitik Kimya alan için önemli bir avantaj sunar benzer Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Araştırmacılar, aşağıdaki adımlara fazla dikkat etmesi gerekir: daha iyi çözme doğruluğu, bu mikro-homojen tüm kuluçkalama içerisinde süspanse edildi doğrulamak ve mikro kodlama işlemi sırasında yıkama aşamaları için gereklidir. Buna ek olarak, kodlanmış mikrosferler, tüm deney boyunca ışıktan korunması gerekir. Uygun kodlama ve depolama prosedürleri takiben, biz genel olarak çözme doğruluk% 99 üstünde olduğunu öğrendim. Kodlanmış mikro-C donma önlemek ve ışıktan koru…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe 08UDE017788-05) tarafından desteklenmiştir. EBP ayrıca Bilim ve Teknoloji İspanyol Vakfı (FECYT) destek kabul eder. Yazarlar yazının eleştirel okuma için Shonda T. Gaylord ve Pratyusha Mogalisetti teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Referencias
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
