纳米力学的药物靶标相互作用及耐药性检测

这些结果表明，悬臂阵列传感器的灵敏度进行检测和定量的药物靶结合的相互作用，特别是在删除一个单一的药物的结合口袋的氢键与万古霉素耐药性的变化。我们展现出的纳摩尔检测灵敏度凡在协议与以前的表面等离子体共振（SPR）的研究^18,19，揭示悬臂方法可以直接检测和量化药物分子在血液中的浓度临床相关常规应用在临床实践中。我们的数据表明，表面应力差，可以说是由一个产品形式（1）式， 即 （一）化学反应的一个化学术语，描述具体的药物靶结合事件，及（ii）之间的机械连接的几何术语，描述面点，这意味着当地的化学作用，从全球的技工去耦人相互作用的悬臂。虽然经典的Langmuir吸附等温化学名词由下式给出，几何术语揭示了渗流机制的药物靶诱导的表面应力的变化。临界阈值个〜10％（ 图5）检测到的差分悬臂弯曲，表示该表面应力集体转导时，一个比较大的表面分数占用的抗生素分子。对于p≥化学转化表面之间的机械连接件，逐步建立，如立体相互作用的纳米机械的网络节点之间的短距离的排斥作用产生增加整个悬臂向下弯曲。据推测，我们的纳米机械的渗流模型可能发挥重要的作用，在真正的细菌糖肽类抗生素的作用方式。这些发现突出的悬臂式技术的高灵敏度为studying抗生素的作用方式和研究的药物，以改善了解抗生素在纳米尺度的操作通知，使强大的药物来控制超级细菌感染的问题，发现代表了一种新的研究工具。要准备悬臂系统，重复性好，灵敏的测量，我们已经解决了一组在协议的目标，尤其是对微细胞样品装载和标准作业程序，让奈米定量检测。

悬臂技术相对于现有方法中的意义

综上所述，我们指出，而这项技术是超过25年前提出的，它没有发现它的方式进入诊所，因为缺乏医疗相关目标的小心和重复测量。在这里，我们演示的程序建立了相关的，使用奈米悬臂调查机械师人抗生素对细菌细胞壁的目标并检测抗菌性的影响。传统的药物筛选方法需要某种类型的荧光或放射性标记的报告分子，测量到它的目标分析物的结合，往往在具有竞争力的或酶的结合分析法和蛋白质检测^20。标记生物分子不仅费时且昂贵的，但该标签也可以干扰与阻碍分子间的相互作用的结合位点，从而导致假阴性。此外，荧光化合物往往是疏水性的，这可能会导致背景结合和假阳性。由于这些限制，是新的标签技术，使几乎任何分子复合体进行甄别，以最小的试验开发的兴趣日渐浓厚。目前历史最悠久的无标签的表面处理技术是SPR和石英晶体微天平（QCM）。到SPR相反，测量第ë键介电常数，标签 – 悬臂技术检测到的配体 – 受体相互作用的，它能够直接测量表面的受体特异性结合的配位体所产生的纳米机械力所产生的表面应变。这些传感器的独特性，其灵敏度不依赖于由于SPR和QCM而是在一个微小的平面应力引起的变化的分析物结合的质量变化引起的介电性能，使该技术特别适合研究药物分子在临床相关的抗生素浓度（3-27微米^）17纳米力学。悬臂也特别适合于小的分子（如DNA片段和药物）检测在生理条件下，包括复杂的环境中，这在很大程度上是制药业的基础，因此，作为在药物发现中的补充工具。悬臂式技术已经成功地应用在基因组学领域的^3,5，气体传感^{21 22，}蛋白质组学，药物^1。此外，低成本的硅技术，由于其兼容性与微细加工流程都采用悬臂，悬臂可以小型化，以提高灵敏度和并行为大型阵列传感器，多种药物的化合物筛选和更高的吞吐量信息丰富的筛选试验。仪器和实验设计的改进将允许在实时帮助推动解决的问题多药耐药感染的新一代superdrugs寻找各种各样的相互作用进行分析。

在协议的关键步骤

强大的测量协议的发展是这项技术的应用。为了达到令人满意的定量的药物靶测量，并确定最低浓度的抗生素吨帽子缓冲区或血液中可检测到血清，在协议的关键步骤解决。第一项任务涉及到调整和优化表面化学捕获提升悬臂检测的特异性和敏感性。不可否认，表面应力传导是一个集体现象，需要一个比较大的部分表面进行覆盖，以建立化学反应区域之间的连通性。我们表明，通过改变下垫面肽的密度，临界阈值，〜P≥10％时，确定规模的肽密度的函数，否则为零（ 图5）的表面应力。重要的是，实验旨在探讨沿悬臂应力的均匀性，敏感的测量，以确保最大的信号偏转。此外，高效的表面恢复协议需要的地方，从而使多个周期的测量，并降低成本，为每个测试通过万吨。在设计使用巯基化的疏水性端的受体表面的受体分子和它们之间的间距，方向是至关重要的允许范明镜范德华分子之间的相互作用，由于密实填充自组装，以减少非特异性相互作用。此外，应包含捕获分子的聚乙二醇（PEG）的连接器，以允许传感矩阵的某些部分是亲水性的，以防止插入待测溶液中的分子与未涂覆的金表面直接反应。 PEG连接分子，必须采取行动，作为间隔，以减少空间约束的，因此允许专门与互动解决方案的分析物的表面受体诱导可测量的表面应力变化。的悬臂阵列传感器必须与至少一个在原位参考测量来测定，在实时显示的信号是一个差分偏转，通过以下方式获得从S中减去绝对的参考悬臂偏转悬臂ensing。因此，参考悬臂考虑到的非特异性相互作用，如温度变化​​，折射率变化或相互作用的悬臂上的非官能化的底面是必不可少的。优化的流动速率（〜30-150微升/分钟）形成于该协议的一个关键步骤，因为它确保高效率地交换液体和溶液的材料有足够的稳定的大量运输。液体电池的设计必须允许最佳体积（5-80微升）采用快的流速，使完美的液体交换，克服大众运输的限制。的流率是特别重要的，同时进行动力学测量^23。大容量液体室要求不可控的高流速，导致大样本量的要求，增加不必要的检测价格。此前，我们已经使用了重力流进入测量液体腔注入不同的样品。重力流的优势在于它的母鹿不要求任何机械部件，因此不会引入额外的噪声进入系统。然而，其显着的缺点是，它不仅可以可靠地工作在相对高的流率（约200微升/分钟）。显然，一个较低的流动速率（≤1微升/分钟）将需要的每单位时间的有限体积的样品，但在另一方面，它使反应更慢，因此需要较长的接触时间。此外，重力流有一个大的差别，它的流速，因为它依赖于，从而降低在实验过程中被消耗样品溶液的入口和出口之间的高度差。要避免重力流问题，注射器泵应该被使用。使用注射泵的优点在于，它允许以恒定的流速在很长一段时间，允许以一种更可控的环境中实现的实验。

的协议的限制

获得重现的主要挑战ð特定的生物检测采用悬臂式传感器在于确保受体层的属性生物化学“有效”，对每个测定均匀。实验成功的秘密是一种谨慎的预处理的传感器芯片与连接器定位在其活性构象的受体分子的化学性质，以标准化的清洗和固定化的协议。在我们目前的体制，我们官能悬臂阵列使用小玻璃毛细管，这可能是受到一些缺点，在某些情况下，可能会出现问题的。在这些玻璃毛细管在两端开口，因此样品的溶剂可以很容易蒸发。例如，如果不能准确地控制官能化阶段的温度时，蒸发速度可以显着不同在不同的时间，尤其是在使用挥发性溶剂，如乙醇。有轻微的变化也有可能在孵育时间从一个悬臂到另一个克尔文感测液体必须连续加载到毛细血管。在毛细管官能化的其他限制因素是缺乏的能力，以确保悬臂总是插入到毛细管中完全相同的方式。另外，有时稍微被拉出，以防止交叉污染的液体样品可以流动到芯片上的身体从毛细血管悬臂。我们可以解决这些问题，作为一种替代的表面涂层过程大衣悬臂采用喷墨监视人。虽然这将允许样品涂层的精确控制的可能性扩大的大型阵列中，最常见的缺点是，沉积到悬臂的小滴可以在几秒钟内蒸发的和需要控制的湿度的环境中。因此，温育时间可以容易地调整，这对于某些应用可能是可取的。微妙的相互作用的因素，如样品VOlume明，孵化时间和蒸发速率官能样品曝光的悬臂上，有直接的影响，必须小心，以确保优化的表面化学悬臂试验，因为任何微小的变化将有很大的影响，在悬臂上的受体分子密度的响应。

实验设计修改（ 即替代技术或材料）

为了克服获得重现涂层过程的悬臂技术的未来发展面临的主要挑战，需要不同的策略，将使用集成在微流体通道的悬臂。这个想法是，特殊的悬臂芯片的设计应使每个悬臂被放置到自己的渠道，让在线渠道单独解决原位功能化程序。这些实验的设计修改将使涂装工艺执行在一个控制和封闭的环境中，暴露到溶剂的精确自动化悬臂芯片上固定化的捕获分子的培养时间和流量监测。然后，相同的信道可以被用于所有悬臂可能会暴露在相同的分析物溶液的实际的结合实验。除了的悬臂官能程序，悬臂读出机制还需要改进。的光束偏转方法是高度敏感的，它已被成功地用于原子力显微镜（AFM）技术多年。然而，为的自由站立悬臂式传感器的应用程序的光学读出有一些缺点，例如它并没有允许不透明的液体，如血液中的测量，激光器阵列的对应的时间，费时和乏味的，将当前配置不能区分倾斜和垂直偏转之间。因此，未来的发展cantilev呃将不得不考虑技术方面的一般传感器的设计（ 如悬臂几何）和悬臂读出强大的测量协议的领域和实验室环境。 Manalis和他的同事²²发达的小说类型，其中有一个嵌入式的微流体通道内的梁悬臂空心悬臂传感器，允许在真空中进行操作的设备提供高品质的因素。在这种模式下，悬臂作为微量天平^22，因此，它不再需要有一个相对于官能化的双方之间的不对称，因此，捕获分子可以被物理吸附或共价键直接连接在硅，通常使用的自组装膜或硅烷^24。的悬臂也可以修改，用薄的聚合物层，然后共轭生化检测抗体^25。

故障排除

一个常见的​​亲事态进一步恶化的悬臂测量与气泡引入到微流体的流动池。必须小心，以确保没有气泡被引入到液晶单元而安装的芯片。信号的漂移也是样品的温度的差异所造成的另一个常见问题。悬臂必须是平衡稳定后再进行测量。所有的缓冲区，分析物溶液和再生溶液必须被存储在同一房间内的悬臂仪器，以允许所有的解决方案，具有相同的温度。虽然注射泵能提供非常精确的和非常低的流速，它一般是与机械噪声的悬臂测量。因此重要的是设计出一种简单而有效的降噪器，以避免不必要的偏转信号中的噪声。降噪器由注射泵和液体的细胞，其吸收吨之间的小储液器他从泵的机械噪声。由于光检测器的敏感性质，悬臂式测量系统最好在一个封闭的设置，以阻止任何杂散光干扰的光学读出系统操作。此外，感测层的质量显着降低，如果大量的洗涤​​步骤的传感器芯片的寿命限制的悬臂上执行。

掌握这一技术后的替代或未来的应用

与终止在氨基或羧基的自组装膜涂覆的悬臂可以用作pH传感器。质子化或去质子化的官能端基取决于溶液的pH值，可以产生表面电荷，导致悬臂弯曲^24。由于悬臂式传感器，可以跟踪与生命细菌的细胞壁^1,6,7不稳定的药物靶相互作用，因此，它们将帮助搜索，并为开发新一代抗生素，以打击耐药菌感染。在未来的悬臂将用作微量天平测量的质量和单细胞的生长率^26。的的悬臂技术将细胞反应，不同的生长因子或药物的研究证明是有益的。它也将快速检测多种生物标志物，里面有直接相关的医疗和护理点的应用提供了一种新的工具。由于悬臂式传感器的通用性，体积小，和鲁棒性，它们将形成一个敏感的监视器的有害环境的影响。他们已证明自己的灵敏度，检测有毒有害气体，可以逃离的实验室和工业生产单元到环境中，如氢氟酸²⁷或氰化氢^28。