<em> Экстракорпоральное</em> Подготовка Изолированные Кишечные нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения взрослой мыши
Summary
We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.
Abstract
Энтеральной нервной системы является обширная сеть нейронов и глии по всей длине желудочно-кишечного тракта, что функционально управляет желудочно-кишечного тракта. Порядок выделения и культуры смешанной популяции нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения описана. Первичные культуры может поддерживаться в течение более 7 дней, со связями среди развивающихся нейронов и глии. Продольная полоса мышцы с мышечно-кишечного сплетения прилагается отделяют от основной круговой мышцы подвздошной кишки или толстой кишки мышей и подвергается ферментативному расщеплению. В стерильных условиях, изолированных нейронов и глии населения сохраняются в осадок после центрифугирования и высевали на покровные. В течение 24-48 ч, происходит рост аксонов и нейронов могут быть идентифицированы по пан-нейронов маркеров. После двух дней в культуре, изолированных нейронов потенциалы действия огня как заметил исследования патч зажим. Кроме того, кишечные глии может быть IDENTIFIED окрашиванием GFAP. Сеть нейронов и глии в тесном аппозиции образуется в течение 5 – 7 дней. Кишечные нейронов может быть индивидуально и непосредственно изучены с помощью таких методов, как иммуногистохимии, электрофизиологии, кальций изображений и одноклеточные ПЦР. Кроме того, эта процедура может быть выполнена в генетически модифицированных животных. Эта методика прост в исполнении и недорого. В целом, это протокол предоставляет компоненты кишечных нервной системы легко манипулировать таким образом, что можно лучше обнаружить функциональность ЭНС в нормальных и болезненных состояний.
Introduction
Энтеральной нервной системы (ENS) является обширная сеть нервов и глии, которая работает по всей длине желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Функционально ENS контролирует все аспекты пищеварения, в том числе перистальтику, всасывание жидкости / секреции, ощущение стимулов, и т.д. (см. обзор 1). Она содержит более 500 млн нейронов, более чем обнаружено в спинном мозге, а также содержит каждый класс нейротрансмиттеров в головном мозге. Кроме того, ЭНС уникальна тем, что он может функционировать рефлекторно без участия центральной нервной системы 2. Понимание ENS имеет решающее значение не только для понимания нормальной физиологической роли, но понять его участие в различных невропатии, которая может быть врожденной (Гиршпрунга болезнь), приобретенных (болезнь Шагаса), вторичной по отношению к болезненных состояниях (диабетическая гастропареза), наркотиков индуцированной (синдром опиоидной кишечника) или из-за травмы (послеоперационная непроходимость кишечника) 1. Кроме того, кишечные нейроны могут быть повторноservoir для вирусных инфекций (ветряной оспы) 3. Из-за его сходства с мозгом и высокий уровень серотонина в кишечнике, препаратов, направленных на лечение центральной нервной системы дефекты часто имеют нежелательные побочные эффекты на ЭНС 2. Следует также отметить, что многие невропатии, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона показывают подобные клеточные изменения в кишечных нейронов задолго до их появления в центральных нейронов, в результате чего ENS доступной моделью для изучения патогенеза этих заболеваний 4. Таким образом, полное понимание ЭНС является необходимым для понимания болезненных состояний и предотвращения / прогнозирования фармакологических побочных эффектов.
Нейроны ENS ранее были изучены в морской свинки Wholemount использованием препаратов 5-7 или культивируемых нейронах 8. Несмотря на легкость, с которой нейроны могут быть изучены в этом большого животного, эта модель имеет много ограничений, в том числеотсутствие генетически модифицированных штаммов, отсутствие реагентов, специфичных для данного вида, и высокие затраты, связанные с заказом и жилищно этим предметам. Развитие мышиной модели кишечной нервной системы имеет уникальное преимущество различных нокаут системы, широкий спектр других установленных методик, которые могут быть использованы в сочетании с методом культуры клеток, а также возможность обеспечить проверку для модели морской свинки .
ЭНС состоит из трех плексигласа, которые работают длина желудочно-кишечного тракта: внешний мышечно-кишечного сплетения (между продольной и круговой мышцы), который в основном отвечает за перистальтического действия кишечника, а также подслизистой и слизистой плексигласа ( и найти в пределах слизистой оболочки, соответственно), которые в значительной степени контролирует всасывание жидкости / секреции и обнаружение стимула 1. Этот метод начинает с выделением продольной мышцы / мышечно-кишечного сплетения (LMMP) подготовка пилингас наружным слоем мышц желудочно-кишечного тракта. Это значительно сокращает загрязнение вопросы, которые возникают, когда слизистая оболочка участвует в изоляции. В результате этого процесса является идеальным для изучения нейронным контролем моторики, а не секреторного действия ЭНС.
Метод, представленный здесь результаты в смешанной культуре кишечных нейронов и глии. По крайней мере, двух различных типов нейронов присутствуют на основе предыдущих электрофизиологических и иммуноцитохимическое наблюдения 9. Наличие глии является большим преимуществом, так как они не только важный тип клеток учиться в их собственном праве, но они способствуют выживанию кишечные нейроны 10 и поддерживают родную экспрессии рецепторов на поверхности клетки нейронов 11. Кроме того, недостатки кишечной глии может привести к нарушениям желудочно-кишечного тракта болезненных состояний, придуманный 12 "нейро-gliopathies. Таким образом, культура ENS представленные здесь Results в нескольких типов клеток, которые созрели для проведения расследования.
Преимуществами данной методики являются простота изоляции, недорогой инструмент требования, и за короткое время освоить технику опытным персоналом лаборатории. Ограничения методики включают в себя низкий общий выход ячейки из больших объемов ткани и исключения нейроны ENS из слизистой и подслизистой сплетения. Эта процедура будет очень выгодно ученым, специализирующимся в электрофизиологии, иммуногистохимии, одноклеточные ПЦР и других методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animals Used
This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and μ-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
Referencias
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neurociencias. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
