Infinium Анализ на крупномасштабных SNP генотипирования приложений
Summary
Протокол описано, что использует Infinium анализов Illumina, чтобы выполнить масштабную генотипирование. Эти анализы могут надежно генотипу миллионы ОНП через сотни отдельных образцов ДНК в течение трех дней. После того, как генерируются эти генотипы могут быть использованы для проверки ассоциаций с множеством различных заболеваний или фенотипов.
Abstract
Варианты генотипирования в геноме человека оказалась эффективным методом для выявления генетических ассоциаций с фенотипами. Распределение вариантов в семьях или популяций может способствовать выявлению генетических факторов заболевания. Панель Illumina в генотипирования BeadChips позволяет исследователям генотип тысячи или миллионы одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) или для анализа других геномных вариантов, таких как число копий, по всей большого числа образцов ДНК. Эти ОНП может распространяться по всему геному и не были направлены в конкретных регионах в целях обеспечения максимальной потенциальной открытие. Infinium анализа была оптимизирована, чтобы получить высококачественные, точные результаты быстро. С правильной настройке, один технический специалист может обрабатывать от нескольких сотен до более тысячи образцов ДНК в неделю, в зависимости от типа массива. Этот анализ помогает пользователям на каждом этапе, начиная с геномной ДНК и заканчивая сканирования массива. Использование приличия reageНТС, образцы усиливаются, разобщены, осаждают, ресуспендировали, гибридизации с чипа, продлен на единой базе, витражи, и просмотрел как на уже высокого разрешения системы оптических изображений ISCAN или Привет Scan. Один одночасье шаг необходим для усиления ДНК. ДНК денатурируют и изотермически усиливается целого генома усиления, поэтому нет ПЦР не требуется. Образцы гибридизуют с массивов во время второй стадии в течение ночи. На третий день, образцы готовы быть отсканированы и проанализированы. Усиленный ДНК может быть складированы в больших количествах, позволяя массивы шарик для обработки каждый день недели, тем самым максимизируя пропускную способность.
Introduction
Ввод одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) является одним из ключевых метод идентификации варианты риска, связанные с болезнью. Исторически сложилось, что сфера генотипирования экспериментов было ограничено имеющейся технологии. Методы генотипирования Гель-электрофорез на основе ограничены в выборки и SNP-пропускной [1]. Развивая эти анализы часто может быть трудоемким, опираясь на макияж и структуры области, окружающей вариант для оптимизации [1]. TaqMan генотипирования анализы, разработанные Life Technologies, может работать большое количество образцов быстро и с минимальным участием техник [2], но ограничения SNP-мультиплексирования продолжают ограничивать общее количество генотипов хорошо под миллион в день [3,4 ]. Платформа Sequenom в Iplex также может работать много образцов сразу, но, как менее сто ОНП могут быть мультиплексированы вместе, пропускная способность сравнительно низкий общий [5]. Технология SNP поток Beckman Coulter втеоретически могли бы производить более трех миллионов генотипов в день, но этот диапазон пределы технологических проект до максимума только сорок восемь SNPs на реакцию [4,6]. В то время как анализ GoldenGate может обрабатывать около двухсот образцов ДНК каждый день на сотни или тысячи ОНП на образец, цена за генотипа не конкурировать с передовыми, техники ультра-высокой пропускной при наборе более трех тысяч ОНП сразу [4,7 ]. Для обработки нескольких миллионов генотипов в день, масштаб требуется для больших генома исследования ассоциации, массив-гибридизации стали наиболее экономически эффективным вариантом на рынке.
Линия Affymetrix в гибридизации массивов и линии Illumina в массивов Infinium основе позволяют потенциально сотни образцов должно быть набрано на сотни тысяч или миллионы ОНП параллельно [4,8]. Эти ОНП могут быть разбросаны по всему геному, локализуется в регионах интересов, таких как эксОмес, или настроить для предпочтений пользователя. Эти массивы имеют преимущество не только быть в состоянии точно генотипу один миллион SNPs на выборку сразу, но и измерить числа копий изменение, потенциально открытие хромосомные аномалии. Infinium выровненные массивы OMNI BeadChip настоящее время имеют возможность генотипа до почти пять миллионов маркеров на образец, в том числе полмиллиона пользовательского локусов, на до почти ста образцов каждый день.
Как большинство болезней имеют генетический компонент, эти крупные эксперименты могут иметь решающее значение в поиске генов, связанных с болезнью. Высокая пропускная генотипирование позволяет эффективно поколения генотипа в образце устанавливает достаточно большой, чтобы убедительно обнаружить генетическую связь при более низких незначительных частот аллелей. Целого генома генотипирования проекты могут быть использованы, чтобы найти области с статистически значимое случай-контроль частот аллелей или число копий различий [9,10,11]. По данным Национального человека GeФ.И.О. научно-исследовательский институт, геномные исследования ассоциаций привело к 1490 отдельных публикациях между 25 ноября 2008 и 25 января 2013, вытекающие из открытия 8283 ОНП с р-значение менее 1 х 10 -5 (см. http:// www.genome.gov/gwastudies/). Эти исследования, исследовал условия, начиная с высоты в рак яичек, выгоду от широкого подхода, предоставляемой всего генома анализа. В таких случаях, целые регионы интерес, возможно, избежал уведомление было объем ввода был слишком ограничительный характер. Таким образом, для крупномасштабной ассоциация анализирует, методика генотипирования генома является методом выбора.
Различные версии анализа Infinium существует, каждый из которых предназначен для использования с конкретными типами массивов. InfiniumUltra анализ, обсуждаются в глубине под, подходит для многих 12 – или 24-образцы чипов массива. Они часто генотипу более ста тысяч ОНП на образец ДНК и сосредоточиться на тargeted регионы, такие как на ExoME или пользовательских панелей. Другие версии анализов может потребоваться для других типов чипов, таких как массивы генотипирования целого генома. Однако, как все анализы Infinium имеют общую основу и в основном отличаются только именами реагентов, объемы реагентов, или точной процедуры окрашивания реагентов, методы совершенные на одной версии анализа часто можно повсеместно. Другие массивы, такие как метилирования массивов, может использовать почти-идентичный протокол, а также. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы только использовать версию анализа, необходимого для данного типа микросхем в использовании. Некоторые виды, такие как те, измерения уровня экспрессии гена, может потребоваться использование протокола nonInfinium.
Образцы должны быть обработаны в пакетном режиме. Например, при анализе InfiniumUltra, предгибридизацию реагентов трубы содержат достаточного объема для запуска 96 образцов, и трубы не может быть замораживать. Таким образом, образцы должны быть запущены в пакетах из 96 образцов одновременно. Образцы будут усиливаться на елейт день. После примерно 1 ч в слесарной, образцы должны быть нагреты в конвекционной печи в течение 20-24 часов. На следующий день, почти 4 часа будут потрачены фрагментацию, осаждая и ресуспендированием образцы, после чего образцы могут быть либо заморожены для дальнейшего использования или гибридизовались с чипом. Загрузка чипов занимает около 2 ч, после чего образцы будут гибридизовали в течение ночи в течение 16-24 часов. На третий день, окрашивание и расширение шаг занимает ~ 4 час. Еще час будет потрачено мытье, покрытие, сушка и фишки. Наконец, массивы сканируются, который может занимать от 15-60 мин / чипа, в зависимости от используемого типа.
Стандартные лабораторную безопасность и чистота соблюдать простые правила безопасности. Хотя усиление не на основе ПЦР, отдельные рабочие станции для предварительного и postamplification процедур необходимы для того, чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения. Идентификационный номер каждого комплекта поставляемого реагента в использовании необходимо войти в систему отслеживания листа. ReageНТС необходимо разморозить непосредственно перед использованием и несколько раз перевернуть перед разливом. ДНК должно быть набрано должен быть высокого качества геномную ДНК (260/280 Отношение поглощение 1,6-2,0, 260/230 оптическую плотность отношение ниже 3,0), выдел ют стандартными методами и количественно с флуорометре. Деградация ДНК часто фактором, способствующим некачественных результатов анализа. Как правило, 200 нг ДНК требуется, хотя это количество может изменяться для некоторых типов чипов. Tecan жидкость обработки робот может автоматизировать многие действия протокола и свести к минимуму человеческий фактор как фактор.
Protocol
Representative Results
Discussion
Крупномасштабные генотипирования приложения были использованы, чтобы лучше понять генетический механизм, лежащий в основе многих заболеваний человека. Открытие любого значительного варианта путем анализа ассоциации генома может махнуть кандидатскую область для дальнейшего изучения. Кроме того, генотип данных является хорошим инструментом для контроля качества на секвенирования проектов.
Чтобы максимизировать пропускную, несколько образцы стекол может быть усилен и хранить в своих фрагментированных, ресуспендировали государств. Восемь пластины могут быть усилены в течение одного дня, сочетая первый 24 ч протокола для нескольких партий и обеспечение достаточно материала для ~ 2-8 дней чип-обработки. Если усиленные пластины находятся на складах заранее, и если новые образцы гибридизации с чипов сразу после сканирования начинается в предыдущем запуске, обработка может работать непрерывно без необходимости сделать паузу для дополнительной подготовки образца. Таким образом, хотя образцы займет три дня, чтобы пройти полноеанализ, данные могут быть получены в день. Assuming24 чипы производятся ежедневно, 5 дней рабочей недели позволяет более 1000 образцов ДНК, которые будут выполняться на шарик чип 12-образца. Если какой-либо этап или реагент не удалось, однако, несколько партий может оказаться под угрозой за плохую работу до того, как коррекция может быть применен. Ошибки могут бежать уведомления до массивы не будут отсканированы или проанализированы, поэтому если пропускная развернуто, сотни образцов в различных стадиях протокола, возможно, уже получили одинаковое неполноценное лечение при обнаружении. Как потеряли реактивы и данные не могут быть восстановлены, пользователь должен взвесить эти риски и необходимостью ускоренного процесса.
Программное обеспечение для анализа GenomeStudio является первый шанс по-настоящему оценить успех процесса генотипирования. Если Норма-R против Норма-тета интенсивности участков должным образом сгруппированы, средняя ставка по телефону (процентов от полной ОНП успешно ввели) образцов должны подходить 99%, при том, что это значение варьируется SLIghtly в зависимости от типа массива. Данные из любого образца со скоростью вызова ниже 85-90% не заслуживает доверия и должен быть уничтожен. Для целей контроля качества, результаты должны быть по сравнению с любыми ранее известных генотипов по мере возможности. Если такой данных не существует, умышленное дублирование образец является полезным инструментом при проверке пластины или массива размещения. Эти повторяющиеся пары должны быть размещены на отдельных чипов, тарелки, партий, или проектов, их генотипы проверены на поколения. Хотя конкретные QC ограничения варьируются в зависимости от предпочтений исследователя, общие ограничения SNP основаны на успех образец вызова, Харди-Вайнберга, или missingness между исследуемой и контрольной, в то время как общие ограничения выборки основаны на скорости соединения, Менделя несоответствий или перекрестных ссылок из Х-хромосомы гетерозиготности к клиническим гендерных данных [13].
Если возникает какая-либо проблема, Dashboard управления, найти в пакет анализа, может быть представленКомпания с целью определения причины. Эти элементы управления могут часто сузить этот вопрос наиболее вероятным шагом или неудачи реагента. Если какие-либо ОНП интересных найдены через генотипирования эксперимента Infinium, их интенсивность участки должны быть перепроверены в GenomeStudio за ошибки кластеризации до дальнейших исследований проводится.
Неудавшийся Infinium генотипирование эксперимент, скорее всего, в результате человеческой ошибки обработки или некачественного входного ДНК. Образец количественное должна быть точной и достоверной. Для достижения наилучших результатов, любые реагенты добавляются в любом образце или чип должен быть отпущены в объеме, установленном протокола. Пипетки должны быть правильно откалиброван. Реагенты не должны проходить по истечении и не должны замораживать После оттаивания, за исключением RA1 реагента. Чтобы свести к минимуму возможные окрашивания и расширения ошибки, формамид / ЭДТА смесь следует приготовить свежую каждый месяц. Все -20 ° C реагенты должны храниться только в ручной разморозки морозильных камер. Все лабораторное оборудование используется в стAining, расширения, и мыть части протокола следует тщательно промыть водой с мягким моющим средством сразу после употребления. Увлажняющий водохранилища в HYB камеры должны быть вымыты с помощью кисти пробирки с мягким моющим средством. Стеклянные слайды должны быть промывают 10% отбеливателя, в соответствии с инструкциями по их руководства пользователя, один раз в неделю.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой работы была предоставлена NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 и NIH R56 AI063274
Materials
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |
Referencias
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5′-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G., ed, . Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. . Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
