Infinium检测的大型SNP基因分型应用

第一天 1。准备免除200纳克的DNA陷入了深深的井，96个样品板。至少有96个样品（全板）必须镀以确保没有试剂将被浪费。标示板与套件中提供的条形码贴纸和离心它。 以归卷，离开样品在抽屉或通风柜一夜之间蒸发的液体。松散覆盖板盖或纸巾，以防止灰尘。 2。放大警告：样品不应该进行扩增，除非4小时将可在翌日的碎片，沉淀和再悬浮的步骤。 除去该公司提供的箱管从-20℃冷冻箱（MA1，MA2及MSM中的一个管是足够的每一组96个样本），标记为“前”或包。设置在板凳上MA2和男男性接触者的管解冻。打开正确校准烘箱，并设置为37℃。 使用试剂盆和一个10微升，8道移液器，取4μL的DNA悬浮缓冲液中，每孔再水化样品。这是没有必要放弃每列之间的枪头如果小心不要接触液体。 用8通道移液器，取20微升的MA1到板的每个孔。对于每一个新的试剂，使用新鲜的试剂盆地。用可重复使用的密封，脉冲离心机，并在1600转的微孔板摇床1分钟旋涡覆盖板。 2.4）在室温下孵育至少30分钟。 分配4微升的0.1N的NaOH到板的各孔中。用可重复使用的密封，脉冲离心机，并在1600转1分钟旋涡覆盖板。 在室温下孵育10分钟。 免除34微升MA2入板的各孔中。 免除38微升的MSM到板的每个孔。覆盖板的可重复使用的密封，脉冲离心机，并为涡旋在1600转1分钟。 放入烤箱20-24小时。 两日 3。碎片从“后1”删除FMS管-20°C箱（一管就足够了每组96个样本）。解冻板凳上或在室温水浴。插入MIDI板插入到桌面微量样品孵化体系后，打开加热块上，并设置为37°C。 一旦管解冻，从烤箱和脉冲离心机除去样品板。免除25微升的FMS到DNA板的每个孔中。更换盖，脉冲式离心机，和涡流在1600 rpm下离心1分钟。 在热块培养板1小时。 4。沉淀从“后3”4°C包装盒中取出PM1管或包和温暖至室温（一管就足够了每组96个样本）。从热集团移除板k和脉冲离心机。 分配50μl的PM1的入板的各孔中。更换盖，脉冲式离心机，和涡流在1600 rpm下离心1分钟。 在热块培养板5分钟。 从加热块取出板，将其关闭，并丢弃板盖。免除155微升100％的异丙醇到该板的各孔中。一个新的盖子捂得严严实实，并手动翻转板多次混合。 放置板在4℃下至少30分钟。打开冷冻离心机，并设置为4℃至冷却。 平衡板和离心机在4℃下静置20分钟，在3000×g下。 检查板的底部不反转，并且确认该样本是沉淀在蓝色沉淀。如果没有小球可以再次看出，离心机。拿纸巾。 丢弃盖子并迅速通过翻转板和覆盖纸巾台式用力拍打它去除液体。一旦该板块是我nverted，注意不要回复它，而任何液体仍然存在。反复敲击板对台式直到所有液体被删除。 在一个试管架，反转设置板，晾干。在室温下孵育1小时。 5。悬浮从“后2”删除RA1 -20°C箱和解冻在室温水浴。打开烤箱，并将其设置为48°C。 一旦解冻，取23微升RA1到样品板的每个孔中。整个瓶RA1的不倾入盆内;节省30毫升后。如果样品将在当天晚些时候进行杂交到阵列，将RA1到4℃凉爽。如果样品将在以后的日子中运行，标签的瓶子和重新冻结的RA1。 热封新盖到板上。脉冲离心机的板，并将其放置在烘箱中1小时。 从烘箱中并涡旋在1,800 rpm离心1分钟，取出板。 样品可以安全地为hELD在这个阶段长达一个星期。板可以储存和样品可能会有所调整，为珠芯片应用程序做准备，如果必要的。如果继续进行过程中，离开该板在室温下，把加热块上。否则，存储板在-20℃下 6。杂交警告：样品不应该进行杂交，除非5.5小时可在翌日的染色和洗涤步骤。 打开加热块上，并将其设置为95°C。打开烤箱，并将其设置为48°C。 一旦温度稳定，孵育板20分钟加热块上。 而板变性，从4℃取出的珠片的框中，然后在板凳上进行设置。拿一瓶XC4的（从室温套件），并添加330毫升100％的乙醇。充分摇匀，并在室温下孵育过夜。制备酰胺/ EDTA混合物（95％甲酰胺，0.2％EDTA（0.5M），4.8％H 2 O的体积比），并冻结在不同的15毫升增量。过量的甲酰胺可堆存。 从加热块中取出的样品板。在室温下孵育30分钟。 虽然该板块冷却，准备HYB室。一室将需要处理每四珠芯片。 放置在HYB室基部的顶部的橡胶垫，对准基座的正面较厚的孔。蚀刻到基条码符号应该仍然可见（ 见图2）。 使用1,000微升移液器，免除400微升PB2到每个雕刻成底座八加湿水库。 PB2可以在“后3”箱或包被发现。放置HYB室盖在基座上，并通过关闭两个扣紧在对角线相对的两侧的第一扣两端。 从他们各自的箱子取出珠芯片的个人银牌包，但是，为了尽量减少芯片的世博会一定要通风透光，还没有打开它们。仔细扫描芯片的条码，并记录在其中，他们将在一个跟踪表被加载，以及他们所来自框的ID的顺序。彻底了解每一个单独的DNA样本将在珠片分配是必要的。 从他们各自的箱子取出珠芯片的个人银牌包，但是，为了尽量减少对芯片的暴露在空气和光线，还没有打开它们。仔细扫描芯片的条码，并记录在其中，他们将在一个跟踪表被加载，以及他们所来自框的ID的顺序。彻底了解每一个单独的DNA样本将在珠片分配是必要的。 就在30分钟冷却完成后，打开银色珠片包。从透明的塑料套中取出芯片。不碰珠，放置在HYB室插入每一个珠片，定向芯片条码与蚀刻到刀片的顶部表面的条码符号。 剥离并丢弃样品板的盖子。取15微升样品从样品板并慢慢分配在入口到阵列（ 见图3）。临时股东必须小心放置正确的样品的正确珠芯片在正确的位置，匹配先前记录的珠芯片订单。多通道移液管可用于分配液体的芯片，但事先考虑必须采取吸样本只数可以被安全地放置在胎圈芯片，作为在平板上的行数并不总是匹配的数目排在一个芯片上。 一旦每个样本被放置其对应的阵列上，目视检查芯片不涂在液体中的气泡或地区。如果存在这些问题，轻轻摇动插入。如果有必要，更多的液体，可以添加到数组中。小心添加正确的DNA样本。 打开HYB室的d将插入的加湿水库。芯片的条形码应放置在蚀刻到HYB室基部的条形码。更换HYB室盖，并通过关闭钩子上斜对面两侧先关闭所有四个钩子。 孵育HYB室中的烘箱中16-24小时。移动它们时要小心不要倾斜室。 如果一个以上的板要被处理，则返回步骤6.2。处理超过24珠片在一天内不建议为了处理双方大量消耗品或芯片时，尽量减少人为错误的可能性，并尽量减少处理芯片在今后的步骤所需的时间量，因为必须小心应当被用来限制其暴露于空气中尽可能。一个瓶子XC4的是足以支持多达24珠芯片。 第三天 7。染色准备从烤箱中取出的HYB室和孵化在室温德温度25分钟。如果在处理两个以上的HYB室，交错的双拆除每10分钟。为了保持芯片的干燥，还没有打开HYB室。 而HYB腔冷却，从“后1”删除XC1，XC2，TEM，STM和ATM的管-20°C箱和板凳解冻的设置。拿一瓶RA1从“后2”盒在-20°C（或4℃，如果重复使用来自前一天的试剂）和解冻在室温水浴。解冻95％甲酰胺的管为好。对于已处理，两管各试剂，将10毫升RA1，15毫升甲酰胺，和150毫升XC3（在室温下，公司提供的包装盒上找到）8珠芯片将是必需的。 对于每一个处理芯片，一是搏命一塑料流通梅开二度，两个金属扣，以及一个塑料垫片是必需的。对于塑料垫片，只使用了很清楚的;分开并丢弃不透明隔板。此外，两个珠芯片洗碗和一个珠子芯片托盘将是需要的，以及一个液体装配站和一个塑料装配杆。 喷洒他们用乙醇和擦拭干燥清洁玻片。 打开该附加到流过腔室的机架的热水浴中，将其设定为44℃。轻轻摇动室机架驱逐任何气泡。 当HYB室冷却25分钟，填补洗菜与PB1（大约200毫升）。 PB1可以在“后4”室温箱被发现。 睁一只HYB室。通过抓住密封在一个角部，并轻轻剥离角（ 见图4）从胎圈芯片取下盖子密封。一旦密封被删除，立即放置在一个芯片珠芯片托盘和淹没在PB1不碰珠。重复，直到托盘充满了珠片，同时注意不要让任何芯片干燥。 轻轻摇动托盘，以消除任何气泡，离开淹没1分钟的芯片。填写第二个洗菜与PB1。再次搅动托盘。 移动的珠片盘进入第二洗的菜。轻轻搅动，让浸泡1分钟，然后再搅拌。 在液体流过组装工段，放置4黑色塑料流动通过括号中的凹槽。填充站与PB1，直到液体几乎达到8装配在方括号（约150毫升）中的高度。 从纸盒中取出一珠芯片，并将其放置到装配站上一个塑料流通支撑。芯片条形码应该高于蚀刻到组装工位的条形码符号被对齐。重复其他三款芯片，可以在装配站内适合。 广场上的珠片顶部的透明塑料垫片。隔离器的外边缘应该装配站内环绕支架。重复淹没在PB1的其他芯片。 通过在凹槽拟合它放置在装配站的塑料装配杆。轻轻地放在载玻片上的塑料垫片的顶部由推压装配杆滑动的后端，慢慢地降低前面到液体中。在滑动的顶部的槽应该朝下，芯片的条形码的正上方，使珠芯片和滑动在条形码端之间的间隙。重复淹没在PB1的其他芯片。对于一个完整的流程，通过装配图， 见图5。 检查芯片与载玻片之间的气泡。如果出现气泡，轻轻抬起滑动的条形码结束，然后再试一次。持久的气泡可以从玻璃用实验室纸毛巾（的Kimwipe）擦拭。 捕捉周围的载玻片两个金属扣，一是对条形码结束和一个朝后。该扣的边缘应握在芯片下的塑性流动，通过支撑。重复淹没在PB1每一个芯片。 拆下完成流过组件和水平放置在B恩奇。小心不要小费垂直装配，使载玻片下的液体逃脱。如果有更多的筹码都在等待在洗脸盘，他们可以在相同的PB1进行组装。如果其他芯片都在等待在原来的HYB室，丢弃所有液体在装配站和洗碗，并返回到步骤7.6。 一旦所有的珠芯片在其流过组件，取一对手术剪，切隔离物的两端关闭时，在靠近玻璃滑动的可能。 8。染色和扩展验证流通室架已经达到44℃，在多个位置有一个温度探头。如果温度超过半度是关闭的，调节水浴的温度。 通过滑动装配下来，钩住支架顶部放置一个珠片流通过装配在室内机架上。胎圈芯片的背面侧，应触摸室架。该g小姑娘幻灯片应朝外，用槽在顶部形成的试剂水库。重复每一个珠片总成。 用200μl移液管，由液体分配到玻璃储添加150微升RA1to流过组件。孵育30秒。重复5倍。 使用1,000微升移液管，由液体分配到玻璃储添加450微升XC1to流过组件。孵育10分钟。 添加450微升XC2以流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育10分钟。 加入200μl的TEM向流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育15分钟。 添加450微升95％甲酰胺/ EDTA混合到流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育1分钟。重复1X。 孵育5分钟，流过组件。 设置热水浴的温度升在STM的管（或37°C如果显示没有）isted。确保每个STM管具有所列出的相同的温度。 添加450微升XC3到流过组件。孵育1分钟。重复1X。 当热水浴温度已达到所需温度时，通过液体分配到玻璃储加250μLSTM到流过组件。孵育10分钟。 添加450微升XC3到流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育1分钟。重复1X。 孵育5分钟，流过组件。 加入250μlATM向流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育10分钟。 添加450微升XC3到流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育1分钟。重复1X。 孵育5分钟，流过组件。 加入250μlSTM的流通通过液体分配到玻璃储集。孵育10分钟。 ADD4 50微升XC3到流过组件的液体分配到玻璃储存。孵育1分钟。重复1X。 孵育5分钟，流过组件。 重复步骤8.14至8.19 1X。 从腔机架上卸下流通组件和关闭水浴。 9。洗涤和封填写染色珠芯片洗菜与PB1（约315毫升）。两个垂直洗碗和一个垂直珠芯片托盘，将需要与至少一个真空歧管。 通过插入卡扣和支架之间的薄金属条，然后旋转拆卸流通组件。抛开载玻片，取出珠芯片。立即将珠片在垂直珠芯片托盘和淹没在PB1。重复每一个流过装配，注意要面对EAC在同一方向H珠芯片和减少其暴露于空气中。 轻轻搅动珠芯片托盘，赶走气泡。孵育淹没珠子芯片PB1 5​​分钟。与XC4填充第二个垂直洗​​菜前一天准备。再次搅动珠芯片托盘。 将珠芯片托盘，洗碟充满了XC4。轻轻摇动托盘，赶走气泡。孵育5分钟，再次搅动。 在一个平滑的运动，拉从洗菜珠芯片托盘和试管架设置，让每一个珠片的脸珠向上。带自锁镊子，滑珠芯片出纸盘并将其放置在一个试管架。重复每一个珠片。 芯片的试管架小心转移到真空干燥器中。关闭和打开真空，确保适当的密封。孵育50-55分钟。如果有必要，孵化期间热身扫描仪。 10。扫描屠RN关闭真空并缓慢的压力恢复到大气压。检查珠芯片都是干的。如果需要的话，擦拭边缘和用纸巾芯片的底部，以消除任何液体或碎屑。 启动扫描软件和移动珠芯片扫描托盘。通过激活解码文件的客户端软件并输入所需的珠芯片的条形码，以及它们对应的框的ID下载芯片的解码文件（DMAPS）。未扫描的珠片可以安全地储存在干燥，避光的地方长达72小时。 一旦芯片正确放置在托盘和解码文件是由软件识别，开始扫描。