大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

初日 1。準備ディープウェル、96サンプルプレートにDNA 200ngの分注する。少なくとも96のサンプル（完全版）がない試薬が無駄にされません確実にするためにめっきされている必要があります。このキットにより供給されたバーコードステッカーとプレートにラベルを付けて、それを遠心する。 ボリュームを正規化​​するために、液体を蒸発させるために、引き出しやヒュームフード晩でサンプルを残して。埃が入らないようにふたや紙タオルで緩くプレートをカバーしています。 2。増幅警告：4時間は、断片化、沈殿、および再懸濁の手順については、次の日に利用できるようになりますしない限り、サンプルは増幅を受けるべきではありません。 -20℃の冷凍庫（MA1、MA2、とMSMの1管は96サンプルの各セットのために十分である）から「プレ」ラベルしたチューブの企業が提供するボックスやパックを取り外します。解凍ベンチにMA2とMSMのチューブを設定します。正しくキャリブレーションさオンにオーブン、37℃に設定試薬流域および10μL、8チャンネルピペットを使用して、サンプルを再水和するために、各ウェルにDNA再懸濁バッファーを4μlを分注する。それは注意が液体に触れないように注意されている場合、各列の間にピペットチップを廃棄する必要はありません。 8チャンネルピペットを用いて、プレートの各ウェルにMA1を20μlを分注する。新しい試薬は、新しい試薬流域を使用しています。再利用可能なシール、パルス遠心機、およびマイクロプレートシェーカーで1,600 rpmで1分間ボルテックスでプレートをカバーしています。 2.4）で少なくとも30分間室温でインキュベートする。 プレートの各ウェルに0.1 N NaOHを4μLを分注する。再利用可能なシール、パルス遠心し、1,600 rpmで1分間ボルテックスでプレートをカバーしています。 10分間室温でインキュベートする。 プレートの各ウェルにMA2の34μLを分注する。 プレートの各ウェルに、MSMの38μLを分注する。でプレートをカバー再利用可能なシール、パルス遠心し、1,600 rpmで1分間ボルテックス。 20〜24時間、オーブンに入れます。 二日目 3。フラグメンテーション 「ポスト·1」からFMSチューブを外し-20℃の箱（1管は96サンプルの各セットのために十分である）。ベンチにまたは室温の水浴中で解凍する。卓上マイクロサンプルのインキュベーションシステムにMIDIプレートインサートを挿入した後、ヒートブロックをオンにし、37℃に設定チューブを解凍したら、オーブン、パルス遠心分離機からサンプルプレートを取り外します。 DNAのプレートの各ウェルに、FMSの25μLを分注する。 1分間1,600 rpmで蓋、パルス遠心分離機、渦を交換してください。 1時間ヒートブロックに静置します。 4。降水量 4℃の箱「ポスト3」からPM1チューブを削除するか、パックし、室温に戻し（1管は96サンプルの各セットのために十分である）。熱圏からプレートを取り外しKとパルス遠心。 プレートの各ウェルにPM1の50μLを分注する。 1分間1,600 rpmで蓋、パルス遠心分離機、渦を交換してください。 5分間ヒートブロック中でプレートをインキュベート。 ヒートブロックからプレートを取り外し、それをオフにし、プレートの蓋を捨てる。プレートの各ウェルに100％イソプロパノール155μlずつ分注する。新しい蓋をしっかりとカバーして、手動で混合するプレートを複数回転倒。 最低30分間​​、4℃でプレートを置きます。冷却遠心機の電源を入れ、冷却するために4℃に設定してください。 3000 X gで20分間4℃でプレート遠心分離のバランスをとる。 それを反転させずにプレートの底を点検し、サンプルが青色のペレット中に沈殿していることを確認します。何ペレットが見られない場合は、再度遠心する。ペーパータオルを取得します。 ふたを捨て、すぐにプレートを反転し、ペーパータオルでカバーベンチトップの表面を強くそれをタップすることで、液体を除去。プレートは私がしたらnverted、任意の液体が残っている間、それを元に戻すしないように注意してください。すべての液体が除去されるまで繰り返し卓上に対してプレートをタップします。 乾燥させるために、反転し、試験管ラックにプレートをセット。 1時間室温でインキュベートする。 5。再懸濁 「ポスト-2」からRA1を除去-20 Cボックスと解凍°室温の水浴中。オーブンの電源を入れ、48℃に設定してください一度解凍したサンプルプレートの各ウェルにRA1の23μLを分注する。盆地にRA1の全体のボトルを入れないでください。後で30ミリリットルを保存します。試料はその日の配列にハイブリダイズされる場合は、4℃のクーラーにRA1を置く。サンプルは後日実行される場合には、ボトルにラベルを付け、RA1を再凍結。 プレートの上に新しいふたをヒートシール。プレートを、パルス遠心し、1時間、オーブンに入れてください。 1分間1800回転でオーブン渦からプレートを取り外します。 サンプルは、安全にHすることができます最長1週間、この段階でELD。プレートを備蓄することができ、サンプルは、必要に応じて、ビードチップアプリケーションの準備のために再編成されてもよい。手続きを進める場合は、室温でプレートを出て、ヒートブロックをオンにします。それ以外の場合は、-20℃でプレートを保存する 6。混成警告：5.5時間染色し、洗浄工程のために、次の日に利用できない限り、サンプルのハイブリダイゼーションを受けるべきではありません。 ヒートブロックの電源を入れ、95℃に設定してくださいオーブンの電源を入れ、48℃に設定してください温度が安定したら、20分間、ヒートブロック上でプレートをインキュベートする。 プレートが変性している間、4℃からビーズチップのボックスを削除し、ベンチの上に置きます。 （室温キットから）XC4のボトルを取り、100％エタノール330ミリリットルを追加。それをよく振って、室温で一晩インキュベートする。ホルムアミド/ EDTA混合物（95％ホルムアミド、0.2％調製EDTA（0.5 M）、体積で4.8％H 2 O）と別個の15mlの増分で凍結する。過剰のホルムアミドを備蓄してもよい。 ヒートブロックからサンプルプレートを取り外します。 30分間室温でインキュベートする。 プレートが冷却されている間、HYB室を準備します。一方の室は処理ごとに4ビーズのチップのために必要とされます。 ベースの前面に厚い穴を合わせて、HYB室ベースの上にゴム製のマットを置きます。ベース内にエッチングバーコードシンボルは、まだ（ 図2参照） を表示する必要がある。 千μlのピペットを用いて、ベースに刻まれた8加湿貯水池のそれぞれにPB2の400μLを分注する。 PB2は「ポスト3」ボックスまたはパックに記載されています。ベースにHYB室蓋を置き、最初の対角線上反対側に2留め金を閉じて両端を握る。 チップ「万博を最小限に抑えるために、それぞれのボックスからビーズチップの個々の銀のパックを削除するが、空気や光にしてください、それらをまだ開いていない。慎重にチップのバーコードをスキャンして、彼らが来た箱のIDと一緒に、トラッキング·シート上にロードされる順序を記録します。それぞれの個々のDNAサンプルは、ビーズチップ上に分配される場所の十分な理解が必要である。 それぞれのボックスからビーズチップの個々の銀のパックを削除するが、空気や光にチップの暴露を最小限に抑えるために、それらをまだ開いていない。慎重にチップのバーコードをスキャンして、彼らが来た箱のIDと一緒に、トラッキング·シート上にロードされる順序を記録します。それぞれの個々のDNAサンプルは、ビーズチップ上に分配される場所の十分な理解が必要である。 30分には、クールダウン直前に銀ビーズチップパックを開き、完了しています。その透明なプラスチックスリーブからチップを取り外します。ビーズに触れることなく、チップを配向、HYB室インサート上のすべてのビーズチップを配置インサートの上部表面にエッチングされたバーコードシンボルをバーコード。 はがれやサンプルプレートの蓋を捨てる。サンプルプレートからサ ​​ンプルを15μlを取り、ゆっくりと、アレイへの入口に分配する（ 図3を参照）。臨時ケアは以前に記録したビーズチップの順序と一致する、正しい位置に正しいビーズチップ上の正しいサンプルを置くように注意しなければならない。マルチチャンネルピペットチップ上の液体を分配するために用いることができるが、先見の明は、プレート上の行の数は、常に数と一致しないように、安全に、ビードチップ上に配置することができるサンプルの数のみを吸引するように注意しなければならないチップ上の行。 一度サンプルは、対応するアレイ上に置かれた、視覚的に液体に塗布されていない気泡や地域のチップを検査します。これらの問題が存在する場合は、ゆっくり挿入を揺する。必要であれば、より多くの液体がアレイに添加してもよい。正しいDNAサンプルを追加するように注意してください。 HYB室ANを開く加湿貯水池の上にインサートを配置dは。チップのバーコードはHYB室基板にエッチングされたバーコードの上に配置する必要があります。 HYB室カバーを元に戻し、最初の対角線上反対側に留め金を閉じて、すべての4つの留め金を閉じます。 16〜24時間にわたりオーブンでHYB室をインキュベートする。それらを移動するときにチャンバーを傾けないように注意してください。 複数のプレートが処理される場合、6.2のステップに戻る。一日に24以上のビーズチップを処理する医療マストなどの消耗品またはチップを大量に取り扱う場合、ヒューマンエラーの可能性を最小限にし、将来の工程でチップを処理するのに必要な時間の量を最小にするために両方のために推奨されないできるだけ多くの空気への曝露を制限するために取られる。 XC4一瓶には、最大24のビーズチップで十分である。 一日三 7。染色の準備オーブンからHYB室を取り外し、室内TEでインキュベート25分間mperature。二つ以上のHYBチャンバを処理する場合は、それらの二重の除去10分毎にずらす。乾燥からチップを維持するために、まだHYB室を開けないでください。 HYB室が冷却されていますが、Cの箱-20「ポスト1」からXC1、XC2、TEM、STM、およびATMのチューブを取り外して、解凍するベンチに設定してください。 （前日から試薬を再利用する場合は4℃）-20℃で「ポスト2」ボックスからRA1のボトルを取り出し、室温の水浴中で解凍する。だけでなく、95％のホルムアミドのチューブを解凍する。 8ビーズチップのため、各試薬の2チューブ、10ミリリットルのRA1、15ミリリットルのホルムアミドを処理し、（室温、同社が提供するボックスにある）150ミリリットルのXC3が必要になります。 処理されたチップ毎に、一枚のガラススライド、一つのプラスチックフロースルーブレース、二つの金属の留め金、および一つのプラスチックスペーサが必要となる。プラスチック·スペーサの場合は、唯一の明確な1を使用し、不透明なスペーサーを分離し、廃棄します。加えて、2ビーズチップ洗浄料理と一方のビードチップトレイは、一液アセンブリ局と1つのプラスチック組立バーと共に、必要とされるであろう。 エタノールを噴霧し、乾燥して拭いてガラススライドを清掃してください。 フロースルーチャンバーラックに取り付けるのは湯浴の電源を入れ、44℃に設定してください優しく気泡を取り除くために、チャンバーのラックを横に振る。 HYB室は25分間冷却したときに、PB1（約200ミリリットル）で洗浄ディッシュを埋める。 PB1は、「ポスト4」は、室温箱に記載されています。 1 HYB室を開きます。 1コーナーでシールをつかみ、ゆっくりと（ 図4を参照）斜めに剥離することにより、ビーズチップからカバーシールを取り外します。シールが除去されると、すぐにビードチップトレイ内のチップを配置し、ビーズに触れることなく、PB1に沈める。トレイは任意のチップを乾燥させないように注意しながら、ビーズチップで満たされるまで繰り返します。 優しくあらゆる気泡を除去し、1分間水没のチップを残して、トレイを攪拌。PB1と第二の洗浄の皿を埋める。もう一度トレイを攪拌。 第二の洗浄皿にビーズチップのトレイを移動します。静かに攪拌し、1分間染み込ませ、再度攪拌する。 液体フロースルー組立ステーションでは、溝の中に4黒いプラスチックのフロースルー中括弧を置く。液体はほぼ8組立金具（約150ミリリットル）の高さに達するまで、PB1とステーションを埋める。 トレイからビーズチップを取り外し、プラスチックのフロースルーブレースに組立ステーションに配置します。チップバーコードはアセンブリステーションにエッチングされたバーコードシンボルの上に揃っている必要があります。組立ステーション内に収まることができ、他の3つのチップについて、この手順を繰り返します。 ビーズチップの上に透明なプラスチックのスペーサを配置します。スペーサの外周縁部は、組立ステーション内にブラケットを取り囲むべきである。 PB1に沈め他のチップについて、この手順を繰り返します。 溝の上に嵌合することにより、組立ステーションでのプラスチック組み立てバーを配置。優しく組立バーに対してスライドの後端を押し、ゆっくりと液体にフロントを下げることによって、プラスチックスペーサーの上にガラススライドを配置。スライドの上部の溝は、ビーズチップとバーコードの末尾のスライドの間に隙間を残して、直接チップのバーコードの上に、下方向に向くようにします。 PB1に沈め他のチップについて、この手順を繰り返します。完全なフロースルー組立図については、 図5を参照してください。 チップとスライドの間に気泡がないか確認してください。気泡が表示された場合は、静かにバーコード終了時にスライドを高め、再試行してください。永続的な泡は、紙の研究室タオル（キムワイプ）で、ガラスから拭き取ることができます。 ガラススライドの周囲に二つの金属の留め金、バーコード終わりに向かって1と後方に1スナップ。留め金の端べきグリップチップの下にプラスチック製のフロースルーブレース。 PB1に沈めチップ毎に繰り返します。 完成したフロースルー·アセンブリを取り外し、B上に水平に置きますench。ガラススライドの下に液体が逃がす、縦にアセンブリを傾けないように注意してください。より多くのチップを洗浄トレイに待機している場合、それらは同じPB1下で組み立てることができる。他のチップが元HYB室で待機している場合は、組立ステーション内のすべての液体を廃棄し、皿を洗って、7.6段階に戻ります。 一旦全てのビーズチップはできるだけスライドガラスに近い、外科用はさみを取り、オフスペーサの両端を切断し、それらのフロースルーアセンブリである。 8。染色および拡張フロースルーチャンバーラックは温度プローブを複数の位置で44℃に達したことを確認します。温度が半分以上程度ではオフになっている場合は、水浴の温度を調整します。 ダウンアセンブリをスライドさせ、上部にブレースをフックして、チャンバラックにビーズチップフロースルーアセンブリを配置します。ビーズチップの裏面は、チャンバラックに触れなければならない。 G少女のスライドは、試薬リザーバーを形成するために、上部の溝に、外を向いている必要があります。すべてのビーズチップアセンブリのために繰り返します。 200μlのピペットを用いて、ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルーアセンブリRA1to 150μLを加える。 30秒間インキュベートする。 5倍を繰り返します。 千μLピペットを用いて、ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルーアセンブリXC1to 450μlを加える。 10分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルー·アセンブリに450μlのXC2を追加します。 10分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルー·アセンブリに200μlのTEMを追加します。 15分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルーアセンブリに450μlの95％ホルムアミド/ EDTAミックスを追加します。 1分間インキュベートする。 1Xを繰り返します。 5分間のフロースルー·アセンブリをインキュベートする。 温度lに熱水浴を設定istedは、STMのチューブに（または37℃いずれも図示されていない場合）。各STM管が記載されている同じ温度を持っていることを確認します。 フロースルーアセンブリに450μlのXC3を追加します。 1分間インキュベートする。 1Xを繰り返します。 湯浴の温度が所望の温度に達したときに、ガラスリザーバ内に液体を分配することによって、フロースルーアセンブリ250μLSTMを追加する。 10分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルー·アセンブリに450μlのXC3を追加します。 1分間インキュベートする。 1Xを繰り返します。 5分間のフロースルー·アセンブリをインキュベートする。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルー·アセンブリに250μLのATMを追加します。 10分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルー·アセンブリに450μlのXC3を追加します。 1分間インキュベートする。 1Xを繰り返します。 5分間のフロースルー·アセンブリをインキュベートする。 フロースルーに250μlのSTMを追加ガラスリザーバーに液体を分配することによって、アセンブリ。 10分間インキュベートします。 ガラスリザーバーに液体を分配することによって、フロースルーアセンブリとADD450μlのXC3。 1分間インキュベートする。 1Xを繰り返します。 5分間のフロースルー·アセンブリをインキュベートする。 繰り返して8.14から8.19 1Xを繰り返します。 チャンバーラックからフロースルー·アセンブリを取り外し、水浴をオフにしてください。 9。洗濯およびシーリング PB1（約315ミリリットル）で染色ビーズチップ洗浄の皿を埋める。二つの垂直洗浄皿と一つの垂直ビードチップトレイは、少なくとも1つの真空マニホールドと共に、必要とされるであろう。 留め金と括弧の間に薄い金属棒を挿入して旋回させることによって、フロースルーアセンブリを分解します。ガラススライドを脇に置き、ビードチップを取り外します。すぐに垂直ビーズチップトレイにビーズチップを配置し、PB1に沈める。 EACに直面するように注意しながら、すべてのフロースルーアセンブリに対して繰り返しHビーズ同じ方向にチップと空気への曝露を最小限に抑えることができます。 穏やかに気泡を除去するためにビーズチップトレイを攪拌する。 5分間のPB1に沈めビーズチップをインキュベートする。 XC4と第二の垂直洗浄の皿を埋める前日用意しました。再びビーズチップトレイを攪拌。 XC4で満たされた洗浄皿にビーズチップトレイを移動します。優しく泡を除去するために、トレイを攪拌。 5分間インキュベートし、再び攪拌する。 そのため、すべてのビーズチップ面にビーズが上向き、1滑らかな動きでは、洗浄皿からビーズチップトレイを引き出し、試験管ラックに設定してください。セルフロックピンセットで、トレイからビーズチップをスライドさせて、試験管ラックに配置します。すべてのビーズチップについて、この手順を繰り返します。 慎重に真空デシケーターにチップの試験管立てを移す。閉じて、適切なシールを確実にする、真空をオンにします。 50〜55分間インキュベートします。必要に応じて、インキュベーション中にスキャナをウォームアップ。 10。スキャニング TU真空からRnとゆっくり大気圧まで圧力を戻す。ビーズチップが乾燥していることを確認してください。必要に応じて、任意の液体や破片を除去するためにペーパータオルでエッジとチップの下部を拭く。 スキャンソフトウェアをアクティブにして、スキャントレイにビーズチップを移動させる。デコードファイルのクライアントソフトウェアを起動すると、それに対応する箱のIDと一緒に、必要なビーズチップバーコードを入力することにより、チップのデコードファイル（dmaps）をダウンロードします。スキャンされていないビーズチップが安全に最大72時間、乾燥した、暗い領域に格納することができる。 チップが正しくトレイに装着されているとデコードファイルはソフトウェアによって認識されると、スキャンを開始します。