Количественный<em> В пробирке</em> Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях
Summary
Нейтрофилов соблюдение активированного эндотелия в местах инфекции является неотъемлемым компонентом воспалительного ответа хозяина. Описанных в настоящем докладе является связывание нейтрофилов, что позволяет<em> В пробирке</em> Количественного определения первичных человеческих нейтрофилов связывания с эндотелиальными клетками, активированными воспалительными медиаторами в статических условиях.
Abstract
Сосудистый эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции. Во время острой фазы воспаления, эндотелиальные клетки (ECS) активируются принимающими посредников или непосредственно консервативных компонентов микробного или хост-полученных молекул опасности. Активированный ЭК экспресс цитокинов, хемокинов и молекул адгезии, которые мобилизуют, активировать и сохранить лейкоцитов в месте инфекции или травмы. Нейтрофилы первый лейкоцитов, чтобы прибыть, и прилипать к эндотелию с помощью различных молекул адгезии, присутствующих на поверхности обоих элементов. Основные функции нейтрофилов непосредственно устранить микробных угроз, направленной на выпуск других лейкоцитов путем выпуска дополнительных факторов, и инициировать заживления ран. Таким образом, их набор и привязанность к эндотелия является важным шагом в инициации воспалительной реакции. В этом докладе мы описываем в пробирке адгезию нейтрофилов анализе с использованиемкальцеин AM меченных первичных человеческих нейтрофилов для количественной оценки степени эндотелия микрососудов клеточной активации в статических условиях. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что такие же образцы количественно с помощью флуоресцентной спектрометрии можно визуализировать непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии для более качественной оценки нейтрофилов обязательным.
Introduction
Так как сосудистый эндотелий находится в прямом контакте с циркулирующей кровью, уникально расположен инициировать быстрое воспалительной реакции во время инфекции или травмы. Эндотелиальные клетки (ECS) выражают распознающих рецепторов, которые распознают различные консервативные бактериальные компоненты и опасности молекул и рецепторов для хозяина воспалительных медиаторов, таких как TNF-alpha. Активация этих рецепторов вызывает ЭК секретируют цитокины (например, IL-6, IL-8, CXCL1 и CCL2) и усиливают молекул адгезии (например, E / P-селектина, VCAM-1 и ICAM-1) на своей поверхности один , 2. Эти молекулы всех облегчения локализации лейкоцитов к локализации инфекции и травмы, чтобы очистить множество инфекционных агентов и инициировать восстановление тканей 3,4. Нейтрофилов ответ на инфекцию предполагает слаженную взаимодействие между сосудистого эндотелия и ответы нейтрофилов. После активации ЕС, IL-8 секретируется и образует внутрисосудистого градиент на эндотелий, который позволяет нейтрофилов к дому, чтобы в месте инфекции или травмы 5,6. E / P-селектинами промежуточных нейтрофилов захвата и катится по относительно слабой ассоциации с glycomolecules нейтрофилов на клеточной поверхности. Эти взаимодействия, наряду с IL-8 связывания с его родственными рецепторами, облегчения надежной, интегрину-опосредованной привязанность и возможного ареста нейтрофилов на поверхности клеток эндотелия 7-10. После ареста, нейтрофилы могут мигрировать из сосудистой конкретных местах инфекции непосредственно устранения патогенных микроорганизмов, генерировать нейтрофилов внеклеточных ловушек для предотвращения распространения патогенных микроорганизмов, способствуют заживлению ран и отпустите дополнительные факторы, которые вербуют других лейкоцитов, таких как моноциты, макрофаги и дендритные Клетки 11-17.
Описанные в этом докладе, в пробирке метод для количественного нейтрофилов соблюдение мкВascular ECs после активации принимающей медиатор воспаления ФНО. Этот тест предназначен для оценки активацию ЭК, а не нейтрофилов. Первичные человеческие нейтрофилы выделяют с использованием первого разделения градиента плотности, а затем метили кальцеин ацетоксиметила (AM). Эстераз в живых клетках гидролизуют кальцеина AM к сильно флуоресцирующего кальцеин молекулы с возбуждением 492-495 нм и излучение 513-516 нм 18. Флуоресцентно меченных нейтрофилы затем инкубировали с монослои EC и не прилипшие нейтрофилов затем удаляются. Флуоресценции из оставшихся, связанного нейтрофилов затем измеряется с помощью флуоресцентного спектрофотометра, и рассчитывается как процент от общего числа нейтрофилов флуоресценции вход на лунку. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что связанное кальцеин меченных нейтрофилы использовали в спектрофотометрии может быть непосредственно визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы дать более качественный считываются из EC переменногоактиваций. Так как это анализ проводят в статических условиях, только очень исходных событий, которые происходят в адгезии нейтрофилов каскад будет оцениваться. Это подтверждается в этом отчет, используя E-селектину блокирующих антител, чтобы показать, что нейтрофилы соблюдение ФНО обработанных легких человека микрососудистой EC (HMVEC-Lung) монослоя резко снижается, когда взаимодействие с E-селектину нарушается.
В дополнение к ФНО, мы успешно использовали эту пробу, чтобы определить степень пупочной вены человека EC (HUVEC) активация Toll-подобный рецептор 1/2 агонисты пептидогликан связанных липопротеинов (PAL), муреин липопротеинов (MLP) и Pam3Cys и HMVEC-Lung активации Pam3Cys 19,20. Кроме того, мы успешно использовали эту пробу с ингибиторы киназы и после RNAi-обусловленный нокдаун поверхности и цитоплазматических белков в HMVEC-Lung, предполагая, что эта методика является совместимым с различными биохимическими и screeninг анализов 20. Таким образом, этот анализ предоставляет простой в использовании, воспроизводимым, более функциональный способ доступа степень активации EC воспалительными медиаторами в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важных шагов для успешной нейтрофилов / эндотелия микрососудов анализа клеточной адгезии являются: 1) использование небольшого числа проход (<9), здоровым клеткам эндотелия; 2) Обслуживание изолированных нейтрофилов при низкой плотности (то есть <5 х 10 6 клеток / мл), …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Департаментом UCSF анестезии и интраоперационной помощи.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
Referencias
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
