Kwantitatief<em> In vitro</em> Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden
Summary
Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor de<em> In vitro</em> Kwantificering van primaire humane neutrofiel binding aan endotheelcellen geactiveerd door ontstekingsmediatoren onder statische omstandigheden.
Abstract
Het vasculaire endothelium speelt een integrale rol in de ontstekingsreactie. Tijdens de acute fase van ontsteking, zijn endotheelcellen (EC) geactiveerd door gastheer bemiddelaars of rechtstreeks door geconserveerde microbiële componenten of gastheer-afgeleide gevaar moleculen. Geactiveerde EC express cytokinen, chemokinen en adhesiemoleculen die mobiliseren, activeren en handhaven leukocyten op de plaats van infectie of letsel. Neutrofielen zijn de eerste leukocyten te komen, en zich aan het endotheel via diverse adhesie moleculen op de oppervlakken van beide cellen. De belangrijkste functies van neutrofielen zijn om direct te elimineren microbiële bedreigingen, de indienstneming van andere leukocyten te bevorderen door het vrijkomen van aanvullende factoren en initiëren wondheling. Daarom is hun werving en gehechtheid aan het endotheel is een cruciale stap in de initiatie van de ontstekingsreactie. In dit rapport beschrijven we een in vitro assay met neutrofieladhesiecalceïne AM-gelabelde primaire humane neutrofielen de omvang van microvasculaire endotheelcel activatie kwantificeren onder statische omstandigheden. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat dezelfde monsters gekwantificeerd d.m.v. fluorescentie spectrofotometrie ook direct worden gevisualiseerd middels fluorescentiemicroscopie voor een kwalitatieve beoordeling van neutrofiel binding.
Introduction
Aangezien het vasculaire endotheel in direct contact met het circulerende bloed wordt uniek gelegen om een snelle ontstekingsreactie tijdens infectie of letsel leiden. Endotheelcellen (EC) express patroonherkenning receptoren die verschillende geconserveerde bacteriële bestanddelen gevaar moleculen herkennen en receptoren voor gastheer inflammatoire mediatoren zoals TNFa. Activering van deze receptoren induceert EC aan cytokinen (bijvoorbeeld IL-6, IL-8, CXCL1 en CCL2) afscheiden, en adhesiemoleculen (bijv. E / P-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) opreguleren hun celoppervlak 1 , 2. Deze moleculen allemaal om de gastheer van de infectieuze agentia wissen en initiëren weefselherstel 3,4 vergemakkelijken lokalisatie van leukocyten naar plaatsen van infectie en verwonding. De neutrofiel respons op infectie gaat een goed gecoördineerde wisselwerking tussen het vasculaire endotheel en de reagerende neutrofielen. Na activatie EC, IL-8 wordt afgescheiden en vormt een intravasculaire gradiënt op het endotheel die neutrofielen maakt om thuis op de plaats van infectie of letsel 5,6. E / P-selectines bemiddelen neutrofielen afvang en rollend door relatief zwakke associaties met glycomoleculen op de neutrofielen celoppervlak. Deze interacties met IL-8-binding aan zijn verwante receptor, vergemakkelijken de robuuste, integrine-gemedieerde hechting en eventuele arrestatie van neutrofielen op de endotheliale celoppervlak 7-10. Na arrestatie kan neutrofielen migreren uit de vasculatuur voor de locaties van infectie direct pathogene schimmels, produceren neutrofielen extracellulaire vallen om de verspreiding van ziektekiemen te voorkomen, bevordering van wondgenezing en laat andere factoren die rekruteren andere leukocyten zoals monocyten, macrofagen en dendritische cellen 11-17.
Beschreven in dit rapport is een in vitro methode om neutrofielen aanhankelijkheid kwantificeren om microvascular EC na activering door de gastheer inflammatoire mediator TNF. Deze test is bedoeld om de activering van EC en niet neutrofielen beoordelen. Primaire menselijke neutrofielen zijn eerst geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradiënt scheiding, en worden dan gelabeld met calceïne acetoxymethyl (AM). Esterases binnen de levende cellen hydrolyseren calceïne AM om de sterk fluorescerende calceïne molecuul met een excitatie van 492-495 nm en emissie van 513-516 nm 18. Het fluorescentie-gemerkte neutrofielen vervolgens geïncubeerd met EC monolagen en niet-hechtende neutrofielen worden vervolgens verwijderd. De fluorescentie van de resterende, gebonden neutrofielen wordt vervolgens gemeten met een fluorescentie spectrofotometer, en berekend als percentage van totaal neutrofielen fluorescentie ingang per putje. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat de gebonden calceïne gemerkte neutrofielen in spectrometrie direct worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie een meer kwalitatieve uitgelezen uit EG ac gevenzendvermogen. Aangezien deze assay wordt uitgevoerd onder statische omstandigheden, zal alleen de eerste gebeurtenissen die plaatsvinden in de neutrofiel adhesie cascade worden beoordeeld. Dit wordt bevestigd in dit verslag met E-selectine blokkerende antilichamen aan dat neutrofielen aanhankelijkheid aan TNF-behandelde menselijke long microvasculaire EC (HMVEC-Lung) monolagen wordt drastisch verminderd wanneer de interactie met E-selectine wordt verstoord zien.
Naast TNFa, hebben we met succes deze assay om de omvang van humane navelstreng EC (HUVEC) activering bepalen door Toll-like receptor 1/2 agonisten peptidoglycan-geassocieerde lipoproteïne (PAL), mureïne lipoproteïne (MLP) en Pam3Cys en HMVEC-Lung activering door Pam3Cys 19,20. Daarnaast hebben we met succes deze test met kinase remmers en na RNAi-gemedieerde knockdown van oppervlakte-en cytoplasmatische eiwitten in HMVEC-Lung, wat suggereert dat deze methodologie is compatibel met een verscheidenheid van biochemische en screening assays 20. Kortom, dit assay geeft een eenvoudig, reproduceerbaar, meer functionele manier te gebruiken om de mate van activering van EG ontstekingsmediatoren in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle neutrofielen / microvasculaire endotheelcel adhesie test zijn: 1) het gebruik van lage passage nummer (<9), gezonde endotheelcellen, 2) handhaven van de geïsoleerde neutrofielen bij een lage dichtheid (dat wil zeggen <5 x 10 6 cellen / ml) en het gebruik ervan binnen twee uur van isolement, en 3) Fastidious wassen van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen en het gebruik van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen tijdig aan EG vervuiling en verli…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie UCSF van Anesthesie en perioperatieve zorg.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
Referencias
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
