Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l'uso di un solvente organico

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi ^13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato ^15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l'esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni ^15. Questo processo determina l'avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni ^15.

Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) ^17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI ^17, ed è questa so-chiamato "reticolazione" di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l'attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule ^18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi ^15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare ^19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio ^20, consentendo l'identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio ^20.

Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina ^6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. ^1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un'alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base ^21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest'ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio "Test di tossicità nel ²¹ ° secolo: una visione e di una Strattegia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l'uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. ¹ e modificato da noi ^2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili ^3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. ^22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata.

Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo ^23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l'inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi ^25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm ^24. L'impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell'uomo ^27-29 e nei corsi d'acqua ^30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che ²⁷ TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle ^31-37. Queckenberg et al. Trovato ³⁷ ~ 10% l'assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono.

TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana ^7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta ^38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici ^2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. ² suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell'importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un'ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che ³⁹ TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata.

Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino ^40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l'ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio ^2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l'interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati ^51. In effetti, secondo Rufli et al. ⁵² e altri ^53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria ^2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation ^54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità.

Non solo è importante considerare l'azione di solventi sull'organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l'effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. ⁵¹ hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti ^50,51.

Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS ² eliminando l'uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm ⁵⁸ con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm ^12.

Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l'ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.