Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler
Summary
Räddning av rekombinanta arenaviruses från klonade cDNA, en metod kallad omvänd genetik, låter forskare undersöka vilken roll specifika virala genprodukter, liksom bidraget från de olika specifika domäner och rester, till många olika aspekter av biologi arenavirus . Likaså omvänd genetik i FDA-godkända cellinjer (Vero) för utveckling av vaccin ger nya möjligheter för generering av effektiva och säkra vacciner mot humana patogena arenaviruses.
Abstract
Utvecklingen och genomförandet av arenavirus reverse genetics representerar ett betydande genombrott i arenavirus fältet 4. Användningen av cell-baserade system arenavirus minigenome tillsammans med förmågan att generera rekombinanta infektiösa arenaviruses med förutbestämda mutationer i deras arvsmassa har underlättat utredningen av bidraget av virala bestämningsfaktorer för de olika stegen i arenavirus livscykel, liksom virus-värd interaktioner och mekanismer för arenavirus patogenes 1, 3, 11. Dessutom har utvecklingen av trisegmented arenaviruses tillåtit användning av arenavirus genomet för att uttrycka ytterligare främmande gener av intresse, vilket öppnar möjligheten till arenavirus-baserade program vaccinvektor 5. Likaså ger utvecklingen av singel-cykel smittsamma arenaviruses förmåga att uttrycka reportergener ett nytt experimentellt verktyg för att förbättra säkerheten av forskning som avser highly patogena humana arenaviruses 16. Den generation av rekombinanta arenaviruses med plasmid-baserad omvänd genetik har hittills förlitat sig på användningen av linjer gnagarcellinjer 7,19, vilket medför vissa hinder för utveckling av Food and Drug Administration (FDA)-licensierade vaccin eller vektorer vaccin. För att övervinna detta hinder, beskriver vi här en effektiv generering av rekombinanta arenaviruses i FDA-godkända Vero-celler.
Introduction
Arenaviruses är höljeförsedda virus med en bisegmented, negativ-strängat RNA-genom 3 som tillhör Arenaviridae familjen. Den arenavirus genomet kodar fyra proteiner i en ambisense mode från två separata virala segment 3. Den stora (L)-segmentet kodar RNA-beroende RNA-polymeras (L) och den lilla ringen (riktigt intressant ny gen) finger protein (Z) som fungerar som den viktigaste drivkraften för virus spirande. Den lilla (S)-segmentet kodar virala nukleoprotein (NP) och ytan glykoprotein (GP) (Figur 1).
Flera medlemmar av Arenaviridae familjen ansvarar för dödlig hemorragisk feber (HF) hos människor 3. Principiellt problem är Lassa virus (LASV) och Junín virus (JUNV), vilka är kända för att orsaka hög dödlighet hos inlagda patienter 8, 9. Även om dessa virus är endemisk till Västafrika och landsbygdens Argentina, respektive,Det finns ökande oro för import av LASV och JUNV till icke-endemiska områden på grund av ökat resande 10. Dessutom, även om inte normalt förknippas med svår sjukdom hos människor, är den prototypiska arenavirus lymfatisk koriomeningitvirus (LCMV) betraktas som en försummad patogen som det har funnits fall av dödlig infektion hos patienter med nedsatt immunförsvar 6, 15 och ansvarar för medfödda missbildningar och missfall hos gravida kvinnor 2, 13. För närvarande finns det inga amerikanska FDA-godkända vacciner mot arenaviruses och behandling är begränsad till nukleosidanalogen ribavirin, som är endast delvis effektiv och förknippas ofta med betydande biverkningar.
Införandet av plasmid-baserad reverse genetics 4 och generering av rekombinanta arenaviruses 7, 19 blivit mycket större inom arenavirus forskning. För närvarande är gnagarceller (såsom BHK-21) som används för geneation av rekombinanta arenaviruses grund av artspecifika murin RNA-polymeras I (pol-I) promotor som styr den initiala transkriptionen av S-och L segmenten. Emellertid virus räddning i BHK-21 celler inte är en godkänd metod för generering av rekombinanta arenaviruses som potentiella vaccinkandidater utsäde. Här kan vi dokumentera användningen av mänskliga Pol-I-promotorn för effektiv räddning av prototypic gamla världen (OW) LCMV och den nya världen (NW) JUNV Candid # 1 stam i Vero-celler. Med hjälp av en liknande metod, genererade vi rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) och Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses som innehåller ytterligare två främmande gener kodas i två olika S-RNA segment 5. Detta nya system inte bara följer en mycket reproducerbar och enkelt protokoll men kan omedelbart genomföras i framtagandet av rekombinanta arenaviruses som potentiella vaccin eller vaccin frön vektor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generation av rekombinanta arenaviruses med plasmid-baserad omvänd genetik har blivit en allmänt använd metod för undersökning av många olika aspekter av arenavirus biologi. Här dokumenterar vi en avgörande förbättring av det nuvarande systemet genom att utföra arenavirus räddningar i Vero-celler, vilket möjliggör den potentiella generationen av FDA-godkända vaccinkandidater mot arenaviruses och vektorer vaccin mot andra infektionssjukdomar.
De experimentella inblandade förfa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar tidigare och nuvarande medlemmar i JCT och LM-S laboratorier för utveckling och förbättring av genetik arenavirus omvänd tekniker och plasmider. Vi tackar även Snezhana Dimitrova för teknisk support. Den monoklonala antikroppen riktad mot JUNV NP (SA02-BG12) erhölls från BEI Resources (NIAID Biodefense och Emerging Infektioner Research Resources Repository). BYHC stöddes av Grant Number GM068411 från Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R är en Fullbright-CONICYT (BIO 2008) och en Rochester Vaccine Fellowship (2012) mottagare. EO-R nuvarande stödet ges av en Postdoktorsstipendium för Mångfald & Academic Excellence från Byrån för fakultetens utveckling och mångfald vid University of Rochester. Forskning i LM-S laboratorium finansieras av NIH bidrag RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAIDEN Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700008C), ochUniversity of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Forskning vid JCT laboratorium har finansierats med bidrag RO1 AI047140, AI077719 RO1 och RO1 AI079665 från NIH.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
Referencias
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
