Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix
Summary
Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.
Abstract
Succesvolle tissue engineering van de combinatie van steigers met geschikte cellen in vitro of in vivo. Steigers mogen synthetische, natuurlijke weg verkregen of afkomstig van weefsels / organen zijn. Deze zijn verkregen met gebruikmaking van een techniek genaamd ontcelling. Decellularisatie kan een combinatie van fysische, chemische en enzymatische methoden omvatten. Het doel van deze techniek is om cellulaire resten behoud van de macro-en micro-architectuur van het oorspronkelijke weefsel te verwijderen.
Darmweefsel techniek heeft tot nu toe gebruikt relatief eenvoudige steigers die niet de complexe architectuur van de inheemse orgel niet repliceren. De focus van deze paper is om een efficiënte decellularisatie techniek voor rat dunne darm te beschrijven. De isolatie van de dunne darm om de instandhouding van een vasculair verbinding te verzekeren wordt beschreven. De combinatie van chemische en enzymatische oplossingen om de cellen te verwijderen whilst behoud van de villus-crypte as in de luminale aspect van de steiger wordt ook uiteengezet. Ten slotte wordt de beoordeling van geproduceerd steigers voor passende kenmerken besproken.
Introduction
Tissue engineering (TE) biedt een therapeutisch alternatief voor orgaantransplantatie, het omzeilen van problemen van immunosuppressie en tekort aan organen. TE heeft onlangs succesvolle toepassingen in de kliniek, met vervanging van organen zoals de blaas 1, urethra 2 luchtpijp, zowel bij volwassenen en kinderen 3,4 5.
Het bouwen van een weefselmanipulatie orgaan vereist de combinatie van een steiger met de geschikte cellen. Een steiger kan worden bereid met behulp van natuurlijke afgeleide (bijvoorbeeld collageen) en synthetische (bijvoorbeeld poly-L-glycolzuur, PLGA) materialen, of worden verkregen door de cellen ontdoen van natief organen en weefsels. Stellingen die tot nu toe zijn gebruikt voor intestinale TE zijn voornamelijk ofwel cellen ontdane (dunne darm submucosa) of synthetische (poly-L-glycolzuur en poly-melkzuur) 6-13. Deze biomaterialen zijn zeer eenvoudig in zowel macro-als micro-architectuur, diemisschien niet ideaal als tissue-engineered darm is te klinisch worden vertaald. Een optimale biomateriaal voor de darm moet een aangeboren vasculaire boom die kan worden aangesloten bloedtoevoer van de gastheer, een gelaagde buisvormige wand met verschillende eigenschappen om de lagen van de darmwand weerspiegelen en villus-crypte as aan de luminale zijde steun met zijn herbevolking door epitheliale stamcellen.
Decellularisatie is een nieuwe methodologie die steigers produceert door het verwijderen van cellen uit hele organen met behoud van de oorspronkelijke architectuur 14. Dit de voorkeur bestaande steigers omdat zij niet alleen repliceren de structuur van het orgaan, maar bevatten ook chemische signalen ingebed in de extracellulaire matrix (ECM) dat steun cellulaire proliferatie en differentiatie. In 2008 werd een cadaveric luchtpijp ontceld 14, bezaaid met de eigen cellen van de patiënt, en getransplanteerd naar de belangrijkste links bronchus vervangen in een jonge man <sup> 3. Sindsdien is een aantal groepen hebben gemeld de productie van cellen ontdane scaffolds voor het hart 15, 16,17 lever en longen 18-20 in kleine en grote dieren.
We hebben ook aangepast dezelfde methode om een dunne darm gedecellulariseerde steiger 21 te produceren. Het doel van de hierin beschreven werkwijze is intestinale cellen ontdane matrices die de macroscopische eigenschappen van het oorspronkelijke weefsel zoals de bloedtoevoer, en de microscopische structuur van het villus crypt-as in de darmlumen handhaven produceren. Wij geloven dat deze methode kan uiteindelijk voor andere organen worden genomen om de efficiëntie van decellularisatie verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De moeilijkste stappen in het opzetten van dit experiment betrekken de infusen van de SMA en de oprichting en het onderhoud van de steriliteit. Cannulating de SMA bij knaagdieren zonder open te barsten de muur kan heel moeilijk zijn te wijten aan de grootte en de positie van het schip. Alternatief kan een hechting worden geplaatst rond het proximale aorta vóór de SMA oorsprong, gevolgd door een canule van de aorta zelf distaal leiding de plastic canule in de SMA. Tijdens decellularisatie een combinatie van slechte canule plaatsing en hoge stroomsnelheden kan resulteren in het verliezen van de vasculaire toegang. Steriliteit is een groot probleem vanwege de hoeveelheid bacteriële flora in de dunne darm. Wassen met PBS / AA volgende oogst is zeer belangrijk, en elk teken van fecale materie of vuil moet uit het lumen verwijderd. Het plaatsen van een deel van de steiger een falcon-buis met DMEM in de incubator volgende UV sterilisatie zou een indicator zijn als steriliteit is bereikt. Bijvan bacteriële kolonisatie, de media de pH veranderen met de kleur draaien van rood naar geel. Om dit, verder UV cycli goed aan het wassen met PBS dat een hoge concentratie van antibiotische / antimycotische.
Een mogelijke wijziging van een steiger met zowel vasculaire en veneuze toegang zou kunnen verkrijgen tot de onderste vena cava (IVC) en de SMA canule. Cellen ontdoen van de veneuze en vasculaire zijden moeten intermitterend uitgevoerd gedurende drie oplossingen. Continue decellularisatie kan de haarvaten barsten doordat positieve druk aan beide zijden.
Door de jaren heen een aantal inspanningen darm TE met andere cel-steiger combinaties in vitro es in vivo 6,9,12 zijn. Het meeste werk werd uitgevoerd gebruikmakend van buisvormige geweven 95% PGA-5% PLGA steigers bekleed met collageen type I 6,7,13,22. Na enten met intestinaleepitheliale organoïde eenheden (OU) en gedurende implantatie in het omentum van muizen, vormen ze cysten met spier aan de buitenkant en aan de binnenkant epitheel die vervolgens kunnen worden tubularized. Echter, de porositeit en eenvoud in het ontwerp van deze scaffolds niet toe voor het genereren van grote stukken kunstmatige darm in een in vitro omgeving zoals een bioreactor. Bovendien, het ontbreken van een aangeboren vasculaire netwerk dat verder kan worden aangesloten op de ontvanger beperkt het gebruik van deze matrix voor klinische toepassing. Naast de experimenten met de PGA-PLGA steigers, hebben andere groepen collageen of SIS steigers, die beide niet de complexiteit van het darmkanaal repliceren gebruikt. SIS in het bijzonder is de enige eerdere gepubliceerde methodologie van darmweefsel engineering en is gebruikt in meer dan 150 medische instellingen, op het aantonen dat gedecellulariseerde steigers mechanische stabiliteit en de celgroei te bevorderen, terwijl looding geen immunogene respons. Echter, het ontbreken van passende macro-en micro-architectuur, heeft geleid tot slechte resultaten in haar 'gebruik voor intestinale TE doeleinden 9-11,23.
De voordelen van de decellularisatie methodiek die we hebben beschreven omvatten het behoud van microscopische kenmerken, zoals de luminale crypte-villus architectuur die een passende omgeving voor de herbevolking vertegenwoordigen door de intestinale stamcellen. In Macroscopisch gezien is de aanwezigheid van een hiërarchische vasculaire netwerk bevestiging aan de ontvanger te schakelen en levering van voedingsstoffen en zuurstof naar alle lagen van de TE-darm 21. Bovendien, het onderhoud van ECM componenten zoals collageen, elastine en glyocosaminoglycans een belangrijke rol niet alleen mechanische eigenschappen maar ook de leiding cellulaire proliferatie en differentiatie. Het belangrijkste is de mogelijkheid van de ontcellen methode worden opgeschaald tot groter weefsels behoud van dezelfde kenmerken is een belangrijke eigenschap voor klinische vertaling van TE.
De ontwikkeling van een natuurlijke darm matrix met een vasculair netwerk maakt het mogelijk grotere segmenten kunstmatige darm die kunnen worden verbonden met de host.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de Wake Forest Institute of Regeneratieve Geneeskunde voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. Wij erkennen ondersteuning door subsidies van het Great Ormond Street Hospital liefdadigheid, de Stichting Eugenio Litta (Genève, Zwitserland), de Medical Research Council, de Royal College of Surgeons of England, de Sparks Children's Medical Charity, het Britse ministerie van Buitenlandse Zaken voor de UK / VS Stem Cell Collaboration Award en het Fonds Mittal Research. We willen ook graag aan de Royal Society / Wolfson Foundation bedanken voor de tissue engineering laboratorium renovatie subsidie verkregen voor de Pediatrische Chirurgie afdeling in het Institute of Child Health. PDC en SE worden ondersteund door het Great Ormond Street Hospital Children's Charity.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
Referencias
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
