Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur
Summary
Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.
Abstract
La technique de patch-clamp est aujourd'hui la méthode la plus bien établi pour enregistrer l'activité électrique des neurones individuels ou leurs compartiments sous-cellulaires. Néanmoins, la réalisation d'enregistrements stables, même à partir de cellules individuelles, reste une procédure fastidieuse d'une complexité considérable. Automatisation de nombreuses étapes en collaboration avec l'affichage de l'information efficace peut grandement aider les expérimentateurs à effectuer un plus grand nombre d'enregistrements avec une plus grande fiabilité et en moins de temps. Afin de réaliser des enregistrements à grande échelle, nous avons conclu l'approche la plus efficace est de ne pas automatiser entièrement le processus, mais de simplifier les étapes expérimentales et de réduire les risques d'erreur humaine tout en intégrant efficacement l'expérience de l'expérimentateur et visuel. Avec ces objectifs à l'esprit, nous avons développé un système assisté par ordinateur qui centralise tous les contrôles nécessaires pour une expérience de patch-clamp multi-électrode dans une seule interface, un commercManette sans fil ially disponible, tout en affichant expérience en matière d'information et d'orientation des indices sur l'écran de l'ordinateur. Nous décrivons ici les différentes composantes du système qui nous a permis de réduire le temps nécessaire pour atteindre la configuration d'enregistrement et d'accroître sensiblement les chances de succès d'enregistrement grand nombre de neurones simultanément.
Introduction
La capacité d'enregistrer et de stimuler plusieurs sites avec une précision micrométrique est extrêmement utile pour atteindre expérimentalement une meilleure compréhension des systèmes neuronaux. De nombreuses techniques ont été développées à cette fin, mais aucun de permettre la résolution des submillivolt obtenue par la technique du patch-clamp, essentielle pour l'étude de l'activité de sous-seuil et des potentiels post-synaptiques individuels. Ici, nous couvrir le développement d'un système de patch-clamp assistée par ordinateur de douze électrode destinée à la stimulation et l'enregistrement d'un grand nombre de cellules individuelles avec une précision suffisante pour l'étude de la connectivité neuronale simultanément. Bien que de nombreuses autres applications peuvent être conçus pour un tel système, il se prête particulièrement bien à l'étude de la connectivité synaptique étant donné que le nombre de connexions possibles à l'intérieur d'un groupe de neurones croît proportionnellement au carré du nombre de neurones en question. Par conséquent, alors qu'un système à trois électrodes permet de tester l'occurrence d'un maximum de six raccordements et d'enregistrement le plus souvent un seul, l'enregistrement douze neurones permet de tester l'apparition d'un maximum de 132 connexions et en observant fréquemment sur une douzaine (Figure 1). L'observation de dizaines de connexions permet simultanément d'analyser l'organisation de petits réseaux et impliquer des propriétés statistiques de la structure du réseau qui ne peut être sondé sinon 1. En outre, la stimulation précise de nombreuses cellules permet également la quantification de recrutement de cellules post-synaptiques 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une question se pose immédiatement général concernant le taux de réussite de la procédure que nous avons décrit. Pour les taux de réussite élevés préparation est essentielle. Les pipettes doivent avoir des ouvertures de pointe qui sont adéquates pour les cellules des êtres enregistrées. Filtrer la solution intracellulaire pour éviter le colmatage des pipettes est également important. Extrêmement propre, pipettes fraîchement tirées sont une autre exigence. Une distribution binomiale est le modèle le pl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, et Sonia Garcia pour de précieux conseils sur l'amélioration de la procédure d'automatisation de patch-clamp. Nous remercions Rajnish Ranjan pour obtenir des conseils et de l'aide avec la mise en œuvre de logiciels utiles. Ce travail a été financé en partie par le projet de l'UE Synapse et en partie par la Human Frontiers Science Program.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referencias
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