ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

1。ゼブラフィッシュ胚の収集と幼虫を育てる "偽の"草（緑糸から作られた）（ 図1）を有するガラスパイレックス皿を夜明けにタンク内に挿入され、ゼブラフィッシュ胚を収集するために、2時間にしておく必要があります。胚を含むガラス皿は、ハンドヘルドストレーナ上に注ぎ、脱イオン水で洗浄されるべきである。胚はその後、卵の水で栽培されるべきである。卵水は脱イオン水やカビ防止剤として使用されているメチレンブルー、0.25 mg / Lででインスタントオーシャンの60 mg / Lで含まれています。 個々の実験の仮説に応じて、胚を直ちに又は毒物または医薬品を使用して、開発の特定の段階で処理することができる。毒物および医薬品は、通常、DMSOに溶解させた（1,000 Xの濃度で）、さらに、卵、水媒体中で直接希釈されるべきである。 医薬品や毒物による胚および幼虫の治療中行動解析7におけるDPF（卵水溶液が真菌/細菌の増殖を回避するために、一日おきに、少なくとも変更する必要があるまで、sが、幼虫及び胚を50 1ml当たり約50〜60幼虫の密度で深いペトリ皿内に収容することができる死者胚から）。 2。行動分析のための金型を準備する特にX 7.6センチメートル×5㎜社内でカスタム構築された11.7センチメートルを測定プラスチック金型を開発しました。金型はサーモサイエンティフィックから単一のウェルプラスチックプレートに注ぎ、アガロースを用いて車線を作成するために必要とされる。シングルウェルプレート対策12.4センチメートルX 8.1センチメートル×1.2センチメートル。 金型の側面を60°の角度を付けている5つのレーンが含まれています。金型内のレーンは底幅が14ミリメートルであるのに対し、最も広い上部に18ミリメートルのベースの高3.5ミリメートルです。金型内のレーン（ 図2）の間に4ミリメートルのギャップがあります。 レーンを準備するには脱イオン内の溶融アガロース（0.8％アガロースを50mlを注ぐシングルウェルプレートに60 mg / Lでインスタントオーシャン）とDの水。金型は、任意の気泡形成を排除する液体アガロースの上に非常にゆっくり配置し、アガロース（約45分かかります）まで冷却したときに除去することができる。 行動実験が実行される前に、アガロースレーンは1日よりも以前に行われてはならない（アガロースが出て乾燥を避けるため）レーンは、最大およそ36時間のために料理に蓋室温で保存することができます。アガロースレーンは、1つの実験のために使用されるべきであり、その後廃棄されるべきである。 3。画像キャプチャ最大20幼虫には、プレートの各レーンに配置することができます。典型的には、レーンごとに5幼虫を泳ぐ速度の最も正確な追跡を容易にするために、実験ごとに必要とされる幼虫の数を減らすために使用される。レーンは卵水でや実験に応じて、医薬品や毒物なしで充填することができる。しかし、レーンはFであってはならない彼らはイメージングキャビネット内に配置されるまで、すべての方法をilled、これはオーバーフローを防ぐことができます。それらはアガロース金型に入れ、ノートパソコンの画面の上部に配置された後の一貫性を保つために、幼虫は、10分の馴化期間を有するべきである。効率的にペトリ皿からアガロースレーンに幼虫を移動すると、幼虫のストレスを軽減するのに役立ちます。幼虫が浅いタンクやペトリ皿に収納されているとき、これは最も簡単です。 イメージングキャビネットは、時間経過の写真撮影やノートパソコンに使わキヤノン製デジタルカメラが含まれています。カメラは、キャビネットの上部に配置され、15.6インチスクリーンのラップトップは、画面（ 図3）上に向けて配置する必要がありますキャビネットの下部に向かって目的とすべきである。 4枚のプレートを直接ノートパソコンの画面の上部に手で位置決めされるべきである。それが（Lの縁に影を排除するためにレーンの上部とレベルであるように、この時点でレーンは卵の水や化学処理をオフに突破することができます画像でanes）。 PowerPointプレゼンテーションは、幼虫のために嫌悪刺激として使用されます。過去動く赤のボールで6または12マルチウェルプレート15,17,18で幼虫ゼブラフィッシュが示された。現在PowerPointはプレートの上半分（ 図4）に移動する赤いバーの15分続いて15分間のために空白の背景から始まります。過熱幼虫を排除するためには、28の上方行かない画面温度がノートパソコンを購入するために最善℃ですアガロースレーン内の液体の蒸発を避けるために、最大の撮像時間を1時間未満に保たれるべきである。 デジタルカメラは、実験ごとに300枚の合計ごとに6秒撮影、タイムラプス撮影にプログラムする必要があります。しかし、周波数および長さは、実験および行動の定量化に応じて調整することができる。過去の拡張イメージングの時代に各画像間の長い間隔を使用して使用した。カマー動画速度（毎秒30フレーム）で画像化のためのより低い解像度に設定することができる。低い解像度では、単一のマルチウェルプレートに録音を制限している間、ビデオ録画は、イメージング急速な水泳イベント15に適しています。 4。画像解析画像はImageJので開くと特に社内で書かれたマクロで使用されるべきである。マクロが自動的に赤い色を除去することができるカラーチャンネルを分割し、バックグラウンドを減算し、しきい値を適用し、粒子分析により幼虫を識別する。 5レーン幼虫分析の最新マクロはZebrafish_macro25kです。画像の数、減算する色、イメージのしきい値などを設定するために、マクロのプロンプトを使用しすべての画像は、ImageJのマクロを介して実行された後に、結果ファイルが表示され、Xが含まれ、yは画像番号とレーン番号と一緒に画像ごとに個別の幼虫の座標。 </李> 結果ファイルは、Excel形式で保存した後、空白の背景対移動バーの背景とよく数に基づいてソートされるべきである。 Excelテンプレートが自動的にウェルに幼虫の配置を決定する方程式に組み込まれ、幼虫の間の距離、移動速度、および残りの量を有する使用されるべきである。最新のExcelテンプレートは、リクエストに応じて入手可能ですCretonラボで作成25ibです。さまざまな治療群を示すグラフは、治療群とコントロールとの比較のためにt検定と一緒にExcelシートに組み込まれなければならない。さらなる統計的分析はSPSSを用いて行うことができる。