Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

La cocaina è uno psicostimolante altamente rinforzo. A seguito di esposizione ripetuta, diversi adattamenti molecolari e cellulari che si verificano in ricompensa rilevanti circuiti cerebrali che si ritiene di provocare compulsivo di droga in cerca di comportamento, provocando alti tassi di recidiva che presentano un grave problema clinico ^1. La cocaina esercita questi effetti comportamentali di lunga durata di regolare l'espressione genica. Per studiare gli adattamenti derivanti da uso cronico di cocaina, roditori modelli preclinici sono stati ampiamente utilizzati. Uno di questi modelli è il luogo preferenza paradigma condizionata (CPP). Tale modello prevede lo sviluppo di una associazione tra un ambiente appreso precedentemente neutro e le proprietà gratificanti della cocaina. Dopo diversi abbinamenti di cocaina con una particolare camera, sono ammessi animali di esplorare liberamente gli ambienti di cocaina-accoppiati e non-cocaina-appaiati e se preferiscono il vano droga appaiati, si dice che essi hanno acquisito un cocaina-indotta place preferenza. Inoltre, a seguito di un periodo di formazione estinzione, questo paradigma può essere usato per studiare al contesto specifico ripristino di cocaina comportamento di ricerca.

Rispetto ad altri modelli comportamentali di dipendenza comportamento simile, come sensibilizzazione psicomotorio, che viene utilizzato per studiare lungo termine indotta dalla cocaina comportamentale e plasticità molecolare ^2,3 e di auto-somministrazione (SA), che si ritiene più esattamente imitare coinvolgente comportamento simile trovato negli esseri umani, il paradigma CPP è una procedura semplice per studiare la cocaina apprendimento contestuale ^4. Protocolli CPP possono essere convenientemente estesi per includere l'estinzione e le fasi di reintegrazione, in modo simile a SA, che consentono di studiare i meccanismi alla base di craving e la ricaduta ^5-7 e che si ritiene di ricapitolare gli aspetti di ciò che avviene in umana droga in cerca di comportamento e droga – e cue-indotto ricaduta ^8-10.

Un meccanismo che sta alla base delcocaina-indotta plasticità comportamentale che è caratteristica di ciascuna delle distinte fasi di CPP, compresa l'acquisizione, estinzione e reintegrazione, è l'attivazione di firme uniche di espressione genica in differenti regioni cerebrali. Per testare direttamente quali geni all'interno di regioni cerebrali premio rilevanti mediare cocaina-indotta cambiamenti comportamentali, è utile essere in grado di manipolare selettivamente in maniera regionalmente specifico. Un modo per raggiungere questo obiettivo è quello microinject vettori ricombinanti adenoassociated virali (rAAV) che esprimono la ricombinasi Cre che utilizzano la chirurgia stereotassica, in aree distinte del cervello dei topi che hanno geni bersaglio affiancati da siti LoxP (topi floxed). Questo metodo consente il controllo temporale e regionale molto preciso quando e dove i geni vengono asportate, in entrambi i neuroni divisione e non la divisione, senza indurre risposte immunitarie ^11-13. Questo livello di controllo rappresenta un importante vantaggio rispetto tecnologia tradizionale Cre-loxP di allevamento topi floxed with topi esprimenti ricombinasi Cre sotto il controllo di un promotore del gene endogeno, in quanto i tempi e la distribuzione di delezione del gene possono essere più strettamente regolata. Inoltre, virali knockout genico mediata da vettori aggira potenziali effetti compensativi inerenti allo sviluppo che possono verificarsi utilizzando strategie di eliminazione diretta tradizionali.

Oltre alla cocaina CPP, che è descritto qui, la microiniezione di rAAV-Cre nel cervello di topi floxed per valutare il ruolo di specifici geni può essere applicato ubiquitariamente a paradigmi comportamentali che coinvolgono fasi distinte, tra cui l'auto-amministrazione e psicomotorio sensibilizzazione. Ad esempio, il nostro laboratorio ha utilizzato la tecnologia rAAV-Cre per studiare il ruolo del Ca _v 1.2 di tipo L Ca ^{2 +} canali in cocaina psicomotorio sensibilizzazione ^14. In particolare, rAAV-Cre stato microiniettato nel nucleo accumbens (NAc) di topi con il gene che codifica Ca _v 1.2 floxed, per dimostrare che Ca _v </sub> 1.2 che agisce in questa regione media la fase di espressione di sensibilizzazione psicomotoria ^14,15. Tuttavia, la strategia rAAV-Cre non può essere utilizzato se non esistono topi con un gene floxed di interesse, come era la nostra esperienza nel valutare il ruolo del Ca _v 1.3 di tipo L Ca ^{2 +} canali di sensibilizzazione psicomotoria. Quindi, una limitazione di utilizzo rAAV-Cre si presenta se non esistono topi condizionali per un particolare gene di interesse. Tuttavia, rAAVs che esprimono siRNA può essere utilizzato per geni bersaglio atterramento, come abbiamo fatto per esaminare il ruolo del Ca _{V 1.3} canali ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre in regioni cerebrali discrete di topi floxed e poi testarle nel paradigma CPP permette di indagine i geni specifici che mediano le varie fasi del comportamento di dipendenza, come e dove operano. L'utilizzo di questo paradigma ha aiutato nella nostra comprensione di come la somministrazione ripetuta di cocaina in sostanza dirotta il brains circuito ricompensa causando cambiamenti adattativi nel molecolari di trasduzione del segnale e l'espressione genica che portano allo stato di tossicodipendente ^1,16,17.