Генетические манипуляции<em> Δku80</em> Штаммов для функционального геномного анализа<em> Токсоплазма</em

1. Генного таргетинга Удаление гена Этот протокол предназначен для эффективной генерации мутантного штамма, который имеет целевой удаление гена в определенном генетическом локусе. Ранее описанные Т. гондий гипоксантин ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HXGPRT) селективного маркера используется в данном протоколе для безопасного и надежного маркера вставки после микофенолокислота и ксантин (MPA + X) отбор 14-16. Этот протокол использует проверенную и экономически эффективный способ построения ДНК ориентации молекул на основе дрожжей рекомбинационная клонирования 17,18. Некоторые альтернативные протоколы являются коммерчески доступными для построения рекомбинантных молекул, имеющих мишень с использованием бактериальной рекомбинационной методами клонирования в пробирке рекомбинационной методами клонирования, или сплав ПЦР. Протокол, описанный ниже обеспечивает самую высокую общую эффективность и надежность восстановления клонированного пунктыITES обладающих целевой делеция гена в Δ Ku80 штаммов T. гондий. 1.1 Подготовка улавливающей ДНК Доступ ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ), чтобы получить геномных последовательностей для представляющего интерес гена (ПИ). Примечание: геномные последовательности должны быть получены от типа I, II или III генома в ToxoDB базу данных, которая находится ближе всего к деформации манипулируют. Например: GT1 для RH и ME49 для Пру. Дизайн специфических праймеров перекрытия, которые усиливают 5 'и 3' геномной ориентации склонов интерес ген (ПИ), включающий 33 п.н. перекрытия с дрожжевой челночный вектор pRS416 (или альтернативно pRS426) и включают 33 п.н. перекрытия с селективным маркером ( HXGPRT) (фиг.1А-В). Добавить уникальный сайт рестрикционного фермента в каждый праймер на обоих концах 5 'Nd 3 'геномной таргетинга флангах, помещается между перекрытием 33 б.п., а Т. гондий конкретной последовательности праймера (ов) (фиг.1А-В). Примечание: более 30 перекрытия п.о. необходим для эффективной рекомбинации клонирование дрожжей. 5 'и 3' геномной ориентации бокам предназначены для амплификации специфических фрагментов ДНК от 800 до 1400 пар оснований, которые определяют целевой удаления. Имейте в виду, что более короткие флангах позволит значительно снизить эффективность адресности в Δ Δ Ku80 hxgprt фоне 2. ПЦР усиливают 5 'целевой фланг с использованием праймеров F1 и R1, и ПЦР усиливают 3'-мишень фланг с использованием праймера F2 и R2 (фиг.1А-С), из геномной ДНК 3. Отдельно ПЦР усиливают ~ 2 т.п.н. HXPGRT ген, включая соответствующие 5 'и 3' фланкирующие области DHFR из HXGPRT кДНК pminiHXGPRT кассета 14 с использованием праймеров HXF и HXR(Фиг.1В-C). Обратите внимание: Усиление целевой бока с использованием геномной ДНК из родительского штамма для трансфекции. Примечание: Место HXGPRT маркер в прямом ориентации по отношению к 5 'и 3' ДНК ориентации бока чтобы облегчить последующее эффективное генетических манипуляций, таких как целевые удаление HXGPRT с нарушенной локуса. Проверьте правильность размеров продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле и оценить концентрацию ДНК-фрагмент использованием агарозном геле стандартов или другой способ определения концентрации ДНК. Создание компетентных аликвотам дрожжей, как описано в Gietz и Schiestly 17. Объединение 50 нг 5 'геномной ориентации фланг, 50 нг 3' геномной ориентации фланг, 100 нг маркер селекции HXGPRT и 50 нг линеаризованной челночный вектор стерильной H 2 O для достижения конечного объема 10 -20 мкл. Трансформации компетентных дрожжи с три ПЦР-продуктов и дрожжей E. палочка челночный вектор для клонирования рекомбинационная использованием протокола описывается Gietz и Schiestly 17. Пластина трансформированных дрожжей на урацил-минус чашках с минимальной агаризованной средой и инкубируют при 30 ° С в течение 2 – 3 дней. Примечание: заказать сборку плазмиды, 5 'целевой фланг, маркер HXGPRT и 3' целевой фланге способствует инженерии 33 б.п. перекрытия между фрагментами ДНК (рис. 1A-B) и опосредовано гомологичной рекомбинации в дрожжей. Урожай дрожжи, добавив 2 мл 2x YPAD на урацил-минус пластин и осторожно выскабливание, чтобы сместить колоний, не нарушая агара. Центрифуга дрожжевой раствор в течение 5 мин при 5000 х г и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок дрожжей в 250 мкл буфера, содержащего ресуспендирования РНКазы А и добавляют 50 – 100 мклCID промытые стеклянные шарики в раствор. Vortex в течение 5 минут на самой высокой скорости, чтобы разбить клетках дрожжей. Разрешить стеклянные шарики оседают на дно пробирки и передачи супернатант в 2 мл пробирку Эппендорфа. Изолят дрожжей ДНК с использованием ДНК изоляции минипрепаративных комплект, ресуспендирования в конечном объеме ~ 100 мкл. Смешайте 2 мкл ДНК дрожжей (~ 50 нг) с 40 мкл DH10B электропорации компетентных E. палочка держится на льду. Передача раствора в охлажденной 2 мм кювету для электропорации разрыв и электропорации клетки бактерий при 2,4 кВ и 129 Ω. Спасательная клетки путем добавления 0,8 мл бульона SOC в каждую кювету и передачи решения 14 мл пробирку с защелкивающейся крышкой Сокола. Клетки инкубируют при 37 ° С на каток в течение 40 – 60 мин. Пластина E. палочки на 2ХУТ + ампициллин (АМФ) пластины и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи. Выбор ~ 6 – 8 отдельных колоний и расти в 3 мл 2ХУТ + AMP в течение ~ 16 часов при 37 ° С. <li> Подготовьте 30% запаса глицерина морозильник каждого E. палочка клона. Выделяют плазмиду pΔGOI из E. кишечной клонов с использованием набора минипрепаративных, ресуспендирования в конечном объеме ~ 100 мкл. Подтвердить pΔGOI использованием рестриктазы дайджесты для измерения ДНК плазмиды размером и проверить ожидаемое ДНК pΔGOI исчерченности. Завершение проверки pΔGOI секвенированием ДНК 5 'и 3' геномной ориентации бока, чтобы проверить 100% ДНК последовательности на основе геномной последовательности данных в http://www.ToxoDB.org . Примечание: Около прекрасного гомологии последовательности необходимо для максимизации эффективности генного таргетинга 3, так как каждая пара оснований разница представляет собой соответствующее сокращение длины идеально гомологии. Примечание: последовательность генома типа II Δku80 штамм на основе родительских ул Прудождь не доступна в данный момент. Эта работа использует тип II ME49 последовательность генома, поскольку суррогатная генома для типа II штамма Δ Ku80. На основании данных о последовательности на количество генетических локусов, предполагается, что ME49 генома и Pru геном обладают полиморфизмы одного нуклеотида на частоте ~ 1 на 10000 нуклеотидов или менее. Создать> 200 мкг со pΔGOI путем посева ~ 250 мл 2ХУТ + AMP ночной культуры с глицерином акции о проверенной E. Клон минипрепаративных палочка. Изолят pΔGOI плазмидной ДНК из большой культуры с использованием изоляции Maxiprep ДНК комплекта ресуспендирования в конечном объеме ~ 1000 мкл. Повтор рестриктазой дайджесты, или секвенирования ДНК pΔGOI Maxiprep ДНК, чтобы проверить правильность ориентации молекулы ДНК до трансфекции. Линеаризовать ~ 15 мкг pΔGOI на 5'-конце использованием уникального рестрикционного фермента Х (RE.X)Дайджест сайт построен в 5 'целевой фланг (рис. 1В). Примечание: генного таргетинга в Т. гондий требует минимум ~ 10 мкг улавливающей ДНК для получения эффективной частоты ориентации событий на генном локусе интерес 2. Подтвердить линеаризации pΔGOI и определяют концентрацию ДНК в агарозном геле или альтернативный метод. Примечание: Если ограничения ферментативного расщепления на 5 'фланге не дает полной линеаризации, разработаны 3' уникальный RE.Y дайджест сайта можно использовать в качестве альтернативного места для линеаризации pΔGOI. Примечание: полностью линеаризованы ориентации молекулы ДНК имеет важное значение для успешного генного таргетинга путем гомологичной рекомбинации в Δ штаммов Ku80. Нейтрализовать ограничение фермента incubatния при 68 ° С в течение 15 – 20 мин. Подготовьте по крайней мере 15 мкг линеаризованной плазмиды в 100 мкл стерильной H 2 O. Магазин линеаризованной pΔGOI при -20 ° С до времени трансфекции. 1.2 Подготовка Т. гондий паразитов, трансфекции, отбор, субклонировании, проверки, архивных и поддержания генетически модифицированных штаммов Общие методы культуры и манипулирование T. гондий в фибробласта крайней плоти человека (HFF) клетки описаны 19-21. Δ Δ Ku80 hxgprt штаммов репликации обычно в паразитом инфекции среды (орлов минимальной поддерживающей среде (ЕМЕМ) питательной среде с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1%-противогрибковые антибиотики разбавляют с 100x акции) 1,2. Вся работа с Токсоплазма должна быть выполнена с использованием уровня биобезопасности 2 процедуры. Т. гондий RHΔ Ku80 2 пареntal штамм был сгенерирован из штамма RHΔ hxgprt от Роос Лаборатории 14. PruΔku80 один родительский штамм был сформирован из PruΔhxgprt (Pru gniaud штамм BSG-4, 22), который содержит стабильно интегрированную CAT селектируемый маркер и зеленый флуоресцентный белок (GFP) репортер под контролем брадизоитного этап LDH2 конкретного промотора. Привить 25 см 2 колбы, содержащей клетки HFF сливающийся с 1 х 10 6 жизнеспособных типа RH Я Δ Δ Ku80 hxgprt паразиты, или привить два 25 см 2 колбы с 2 х 10 6 жизнеспособных типа II Prugniaud (Пру) Δ Δ Ku80 hxgprt паразитов. Примечание: жизнеспособных паразитов определяются как внеклеточных паразитов, которые недавно лизировались вне. Примечание: </strong> Эта шкала обеспечивает достаточное количество жизнеспособных паразитов для трех экспериментов трансфекции. Осмотрите Δ Δ Ku80 hxgprt Инфицированные культуры ~ 68 – 72 часа после заражения. Убедитесь в наличии жизнеспособных паразитов и ~ 90 – 95% лизис клетки HFF планировать точные сроки трансфекции. Примечание: изоляция недавно egressed паразитов имеет важное значение для успеха этого протокола, так как низкая жизнеспособность паразита отменят ген-таргетинга эффективности. Перемешивают жизнеспособных паразитов в раствор путем закрытия плагин уплотнение крышки на 25 см2 колбу и энергично встряхивать колбу назад и вперед для перемешивания паразитов от ростовой поверхности без разбрызгивания жидкости на внутренней стороне крышки или горло колбы . Примечание: паразитов урожай не требует шприца игла выпуска протокол для типа I илитип II Δ Ku80 штаммов. Передача паразита раствора в 10 мл шприца прикреплен к держателю фильтра, содержащих 3 мкм мембрану и поместите фильтр в верхней части открытого 15 мл завинчивающейся крышкой трубки. Шприцевой фильтр паразитов в 15 мл с завинчивающейся крышкой трубки. Примечание: фильтрация паразитов через мембрану удаляет инфицированных клеток и клеточного дебриса. Определение концентрации паразитов (тахизоит формы на мл) с использованием гемоцитометра. Примечание: Дополнительно: Использование паразита решения, создана бляшкообразующие блока (PFU) анализа 21, который будет прочитан 7 – 8 дней, чтобы определить адекватную жизнеспособность трансфицированным паразиты (ОРП тахизоит отношением ≥ 0.2). Гранула паразитов в течение 7 минут при 1400 х г и супернатант до ~ 0,4 мл, не нарушая паразита гранул. Вращаться в течение 2 мин при 1,400 XG и аспирации супернатант оставшееся до ~ 0,01 мл, не нарушая паразита гранул. Ресуспендируют осадок паразита, щелкая нижней части трубы и сразу же добавить cytomix 23 буфера (1.33x концентрация) для паразита гранул для получения паразита концентрации 4 – 5 × 10 7 паразитов / мл cytomix. Примечание: пропустить добавлением АТФ и глутатиона cytomix поскольку эти дополнения не повышение эффективности генного таргетинга. Разморозить 100 мкл аликвоты линеаризованному pΔGOI из протокола 1.1 (шаг 26). Передача 0,3 мл раствора паразита cytomix (~ 1,3 – 1,6 · 10 7 паразитов) в 100 мкл линеаризованной pΔGOI с протоколом 1,1 (шаг 26), и немедленно передать всю 0,4 мл паразит + pΔGOI смесь к охлажденному 2 мм зазор кювету для электропорации. Электропорации паразитов на 1,4 кВ и 24 Ω. Resт трансфекции кювете при комнатной температуре в течение ~ 5 мин, затем передавать все содержимое трансфекции кювету в 150 см 2 колбу, содержащую сливной клетки HFF с 30 средних инфекции мл и инкубируют инфицированной культуры в течение ночи. Начать выбор в микофеноловая кислота + ксантина (MPA + Х) ~ 20 часов после трансфекции (фиг. 2A), заменив инфекции среде с MPA + X селективной среде (MPA (25 мкг / мл) и ксантина (50 мкг / мл) в инфекции среды). Примечание: Не беспокоить инкубации MPA + X выбор колбу. Оценить общее количество блоков PFU в MPA + X выбор колбу ~ 8 дней после трансфекции путем визуального осмотра монослоя. Убедитесь в наличии разработке блоков PFU и здоровой зоны инфекции с помощью световой микроскопии. Примечание: Если бляшки не видны днем 8, сохраняют выбор и следить за признаками заразитьиона, так как мутантные штаммы могут иметь льготный тариф репликации. Примечание: Δ Δ Ku80 hxgprt штаммов паразита имеют чрезвычайно низкую фоне нежелательных нецелевые событий, что позволяет для успешного выделения мутантных штаммов с довольно тяжелой, но не смертельной дефекты роста. Если ген имеет важное значение и она не может быть удалена, первичный трансфекции или впоследствии передается паразит населения, может выявить фенотип, где паразитов прекращают репликацию в процессе выбора, поскольку население решает целевых нокаутом. Встряхните колбу как в шаге 3, чтобы выбить внеклеточных паразитов из монослоя [после видимого бляшек разработали] для генерации паразита решение. Передача ~ 0,5 мл паразита раствор из MPA + X выбор колбу на 25 см 2 MPA + X выбор колбу, содержащую сливной клетки HFF (назначают этой культуры проход 1А). Выбить паразитаы в оригинальной 150 см 2 МПа + X выбор колбу ~ 3 дня спустя и передачи ~ 0,5 мл паразита решение второй 25 см 2 МПа + X выбор колбу, содержащую клетки HFF сливающийся (1B обозначения этой культуры проход). Разрешить зонах инфекции развиваться в проходе 1А и / или пройти 1B для колб ~ 5 дней. Визуально проверить с помощью световой микроскопии, что проход 1А и 1В колб содержать минимум 25 жизнеспособных блоков PFU со здоровыми зон заражения. Выберите либо 1А проход или колбе проход 1B для продолжения проход в MPA + X селективную среду в 25 см 2 колбы. Поддерживать проход под MPA выбор + X. Примечание: Паразиты должны быть выращены в течение достаточного числа поколений, чтобы удалить неинтегрированных сохраняющейся эписом из популяции до субклонирования. Не выполняйте субклонировании до 20 дней после трансфекции для типа RH Я Δ Δ Ku80 hxgprt, или до 25 дней после трансфекции дляТип II Пру Δ Δ Ku80 hxgprt паразитов чтобы было достаточно времени, чтобы разбавить неинтегрированные эписом 1,2. Субклон паразитов в 96-луночный лоток, содержащий сливной клетки HFF с MPA + селективной среде X. Подготовьте один лоток в концентрации 1 паразита / лунку и второй лоток при концентрации 2 паразитов / лунку. Примечание: Субклон паразитов, которые недавно лизируют (~ 90 – 95% от HFF клеток в 25 см 2 колбы) для того, чтобы паразиты имеют высокую жизнеспособность. Примечание: оптимальный срок после трансфекции для субклонирования была создана путем измерения, как быстро успешно целевых паразитов возникают при высокой частоте в выбранном населения 1. Продолжайте прохождение первичного населения трансфицирован паразитов в MPA + селективной среде X Использование еженедельный график прохождения заражение25 см 2 HFF колбу с 10 мкл паразита раствора. Примечание: если клонов проведение целевых делеции гена (нокаутом) не получается из первого субклонирования в шаге 18, resubclone паразитов из непрерывно поддерживается население ~ 10 – 12 недель после трансфекции. Примечание: Одна из причин, делеция гена не получено возникает из эписомными сохранением некоторых плазмид pΔGOI. Эписомными стойкость определяется последовательностей, содержащихся в 5'-и 3'-геномной ориентации боках и видимому, не возникают из HXGPRT генетического элемента. Около 5 – 10% от ориентации плазмиды обладают значительной эписомными стойкость, которая требует более позднее время субклонирования, чтобы позволить паразита населения достаточным количеством поколения раз, чтобы разбавить сохраняющейся эписом и решать население в основном стабильны интегрантов. <ol starт = "20"> Оценка 96-луночный лоток 6 – 7 дней после субклонирования (тип I паразитов) или 7 – 8 дней после субклонирования (тип II паразитов) для лунок, содержащих одну PFU, определены как одну зону инфекции в световой микроскопии при либо 40X или 60X власти. Отметить небольшой точкой на 96-луночных лоток крышкой для обозначения расположения PFU в скважине. Смешайте содержимое каждой лунки, содержащие один PFU с помощью пипетки установлен в 50 мкл (200 мкл наконечник) путем направления потока текучей среды по PFU разойтись паразитов в скважине. Примечание: Смешивание также ускоряет паразита лизис монослой HFF. Тип I RH штаммов растворит хорошо ~ 4 дня после смешивания, тип II Пру паразитов растворит хорошо ~ 5 дней после смешивания. Выбор десятков лизировали скважины (клоны) и царапин в нижней части каждого из этих лизированных скважин с использованием 0,5 – 10 мкл кончиком пипетки одновременно составление 6 мкл раствора паразита. ТрансТЭР 6 мкл паразита решений для хорошо известных в 24-и сливной лоток, содержащий клетки HFF в 1 мл MPA + X селективной среде. Примечание: Важно, чтобы царапать нижней части так, чтобы держать отверстие отверстие наконечника пипетки в постоянном контакте с паразитами, проживающих в нижней части скважины. Монитор 24-луночных лоток для лизиса клетки HFF. Примечание: тип I RH паразиты, как правило, хорошо растворяя в 24-луночный формат в ~ 4 дней. Тип II Пру паразиты, как правило, хорошо растворяя в ~ 5 дней. Передача 2 мкл эффективным решением паразита поцарапаны от нижней части каждой лунки в 24-луночный планшет в соответствующую лунку нового 24-луночных сливной лоток, содержащий клетки HFF и 1 мл MPA + X селективной среде на лунку. Примечание: Все паразиты клонов и линий можно непрерывно основныхполученные путем пропускания 2 мкл жизнеспособным решением паразита каждые 7 дней в этой 24-и лоток формата. Убедитесь, что паразиты были успешно перенесены на новый 24-а лоток визуальном осмотре световой микроскопии ~ 18 ч после прохода. Урожай паразитов из лизированных лунки 24-луночного лоток с шага 23 – 24 с использованием либо 1 мл или 10 мл пипетки и перенос паразита раствор в пробирку Эппендорфа. Гранул паразитов при 1400 х г в течение 7 мин, промывают один раз в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), и осадок снова при 1400 х г в течение 3 мин. Aspirate PBS от осадка, затем добавьте 200 мкл PBS к осадку, чтобы ресуспендировать паразитов. Зафиксировать паразита раствор при -80 ° С до выделения ДНК. Изолировать паразита ДНК из каждого клона использованием изоляции ткани ДНК MINIKIT. Проверка целевого удаление гена (нокаут) методом ПЦР с использованием праймеров проверки (Фиг.2А-С). ИспытаниеОтсутствие функциональной кодирующей области гена и использование CxF вверх по течению и ниже по течению CXR геномной ДНК праймеров (фигуры 2A-B), тест на наличие ПЦР-продукты, которые охватывают геномной ориентации боках и HXGPRT описывает правильное 5'-и 3' "направленной интеграции в HXGPRT гена в локусе гена удален. Примечание: Праймеры для проверки должен быть уникальным для представляющего интерес гена или ложный положительный результат может быть получен. Грунтовка дизайн может быть утверждена http://www.toxodb.org взрывным последовательности праймеров к геному (ы), чтобы проверить праймеров являются уникальными. Прохождение паразита клонов на недельном графике как описано в пункте 24. После удаления целевых подтверждена, продолжается отбор в MPA + X не является обязательным. Архив клонов паразита путем подготовки морозильник запасов. Гранула внеклеточных паразитовиз лизированных клеток HFF в 25 см 2 колбы культуры, средств массовой информации и удалить аккуратно ресуспендируйте паразита осадок в среде клеточной культуры при замораживании паразит концентрации> 4 х 10 7 паразитов на мл. Передача аликвоты и хранят криопробирок паразитов до бесконечности в жидкий азот, или при -80 ° С. 2. Удаление HXGPRT Этот протокол предназначен для удаления HXGPRT маркер от сайта интеграции в геноме генетически модифицированных Δ Ku80 штамма. Удаление HXGPRT позволяет извлекать маркер и генерации штаммов с множественной генетических манипуляций с использованием только выбор на основе HXGPRT 1-3. В то время как протокол подробно описаны ниже описывается метод повторной целевой локус, чтобы удалить HXGPRT, следует отметить, что удаление HXGPRT на генном локусе интерес также позволяет одновременно повторной интеграции гена дикого типа (сomplementation), повторное интегрирование мутантный ген, а также повторное интегрирование меченый ген (N-или С-концевых GFP, HA тег, и т.д.,), что позволяет для различных генетических манипуляций. Механизм действия 24 и ориентации протоколов с использованием 6-тиоксантина выбора были ранее описаны 1-3,15. 2.1 Удалить HXGPRT Акцизный HXGPRT селективный маркер от pΔGOI расщеплением с RE.Z чтобы разрезать по уникальной сайты рестрикции фланговые HXGPRT (рис. 1В). Проверка полное переваривание ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Изолировать большей из двух полос из геля агарозы. Примечание: больший из двух полос содержит плазмиду вместе с 5 'и 3' бока ДНК-мишени, но не HXGPRT гена. Поместите разделе агарозном содержащих более значительные полосы ДНК в Layin колонке спинаг геля плоский на мембране. Спин колонку при 13000 х г в течение 4 мин при комнатной температуре. Добавить стерильной Н2О в проточном, чтобы довести объем до 100 мкл. Примечание: другие коммерческие методов для выделения ДНК из агарозы. Концентрат ДНК путем осаждения этанолом, ресуспендирования ДНК в конечном объеме 18 мкл стерильной H 2 O. Смешать 1 мкл концентрированной ДНК с 7 мл H 2 O, 1 мкл 10х буфера лигирования и 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (5 единиц) и поместить реакции при 4 ° С в течение ночи для получения pΔGOIc (pΔGOIclean) (фиг. 3А). Примечание: фрагменты ДНК с RE.Z содержащие концы ДНК могут быть разработаны и включены в это шаг, чтобы создать плазмиды подходит для целевого повторной интеграции гена дикого типа (дополнения), целевые повторной интеграции мутантный ген, а также целевые реинтеграции отмеченных гена(N-или С-концевых GFP, HA тег и т.д.). Разбавляют реакционную 2x стерильной Н2О до электропорации. Преобразование pΔGOIc в E. палочки, как в протоколе 1,1 субклонировать, изолировать и проверять адресности плазмиды. Тогда линеаризуем pΔGOIc в рамках подготовки к трансфекции (см. шаги 1.1.11 к 1.1.26). Повторите паразита протокол трансфекции, как указано в протоколе 1.2 (шаги с 1 по 11). Примечание: Перед проведением шаги с 1 по 8, убедитесь, что целевые удаление HXGPRT возможно в мутантный штамм. Заразить 150 см 2 колбы вырожденные клетки HFF 1 × 10 6 тахизоиты мутантного штамма с использованием 6-тиоксантин (6TX) Выбор среды (200 мкг / мл 6TX инфекции в среде) и колбу помещают в анализе PFU. Осмотрите колбу 8 дней, чтобы убедиться, что нет (или очень мало; <10) PFU не видно, что очень важно установить, что потенциалпространственной ориентации генных эффективность превысит любые потенциальные спонтанной реверсии мутантного штамма к фенотипу с пониженной экспрессией HXGPRT (6TX фенотип сопротивление). Примечание: примерно 5 – 10% сайтов HXGPRT интеграции проявляют значительный и спонтанной частоты 6TX сопротивления хотя HXGPRT маркер еще интегрированы на целевом сайте (см. раздел Представитель Результаты пояснения). Начать 6TX выбор ~ 20 часов после трансфекции путем изменения среды в 150 см 2 колбу 6TX селективной среде. Примечание: Не беспокоить колбу в течение ~ 10 дней после трансфекции. Осмотрите колбу для формирования PFU на 10 день – 12 после трансфекции (тип I паразитов) или 10-й день – 16 после трансфекции (тип II паразитов). Примечание: ParasiTES мишенью для удаления HXGPRT не начнет расти под 6TX выбора, пока HXGPRT генов и мРНК не будет удалено, а остаточный белок HXGPRT инактивируется. Встряхнуть выбор колбу создать паразита раствора и передачи 0,5 – 1,0 мл паразита решения новой 25 см2 колбу, содержащую сливной клетки HFF и 5 мл 6TX селективной среде. Повтор передачи от первичного 150 см 2 до нового 25 см 2 колбы один раз в день в течение еще ​​двух дней. Примечание: Несколько выборки повышает шансы на захват целевых жизнеспособные паразиты, которые потеряли HXGPRT гена. Проверьте 25 см 2 колбы ~ 5 дней после заражения, чтобы проверить наличие разработке блоков PFU с зонами здоровых репликации паразитов. Выбор одного или двух колбах, содержащих зоны инфекции. Примечание: </sЧонг> Паразиты удален из дублирующих генов HXGPRT с нормальной скоростью роста 6TX выбора. Продолжайте прохождении паразитов в 6TX селективной среде. Субклоном населения паразита через 25 – 30 дней после определения. Установить с 96 лунками, поднос с ~ 1 паразита / лунку, а другой с ~ 2 паразитов / лунку. Подготовка паразита ДНК из выделенных клонов и клонов поддерживать в 24-луночный планшет культуры в соответствии с протоколом 1,2 (шаги 19 до 29). Подтвердить удаление HXGPRT помощью ПЦР с использованием стратегии, изложенной на фиг.3А-B. 3. С-концевой Мечение белков Этот протокол предназначен для С-концевого мечения белков путем воздействия на тег для интеграции через двойной крест над гомологичной рекомбинации в геномного локуса гена использованием MPA + X выбор 2,4. Этот протокол работает эффективно, потому что 5'-DHFR последовательность <em> HXGPRT маркером является полностью проверены функциональные 3 'нетранслируемой области для других генов 2,4. 3.1 Прямое С-концевого мечения белков при эндогенных генетических локусов Создать таргетинга pΔGOItag плазмиды построить использованием дрожжей рекомбинационная клонирования (рис. 4) и методы, описанные в протоколе 1.1. 5 'геномной ориентации фланг содержит последние 800 до 1200 пар оснований кодирующей области (или геномной ДНК) ПИ, за исключением кодона терминации перемещается в положение 3' к тегу выбора (HA тег, Myc тег Его тег и т.д.) Создание целевого введения C-концевой метки с эндогенным локусом белок-кодирующих генов, следуя инструкциям в протоколе 1.1 и 1.2 с использованием стратегии, изложенные (рис. 4). Убедитесь, что вставка С-концевой метки на эндогенный локус гена с использованием стратегии ПЦР. Retarget локуса гена использованием методов, описанных в протоколом 1 и 2 до Delete HXGPRT селективный маркер для создания точно регулировать эндогенный локус гена, который выражает меченый белок. Этот протокол также восстанавливает HXGPRT селектируемый маркер, который может быть использован повторно целевой другом локусе помеченный деформации (см. протокол 1).