Эксплуатация настольной биореактора
Summary
Ферментеры используются для повышения урожайности культуры и продуктивности биоинженерных клеток. После проверки нескольких микробных или животных кандидатов клеточных культур в колбах, следующим логическим шагом является увеличение биомассы от выбранной культуры с ферментер. Это видео демонстрирует настройку и работу типичной системе настольный биореактора.
Abstract
Брожение системы используются для обеспечения оптимальных условий роста для многих различных типов клеточных культур. Возможность, предоставляемая ферментаторах тщательно контролировать температуру, рН и концентрации растворенного кислорода в частности делает их необходимо эффективного роста крупномасштабной и экспрессии продуктов брожения. Это видео будет кратко описать преимущества ферментер над вибрирующей колбе. Она также определит ключевые компоненты типичного настольного системы ферментации и дать базового обучения на установке судна и калибровки его зондов. Зритель будет ознакомился с процессом стерилизации и показали, как привить питательную среду в сосуде с культурой. Также будет продемонстрировано Основные понятия работы, отбора проб, и уборки урожая. Также будут обсуждаться Простой анализ данных и системы очистки.
Introduction
Базовая технология ферментации является продолжением той простой встряски техники колбы для выращивания культур. Он вырос из желания контролировать среду роста для живых культур в более полной и количественно. Пакетные посеву колбы, как правило, ограничивается неточной контроля температуры. Однородность температуры в шейкер-инкубатор или теплом помещении сильно варьирует, иногда отклоняясь от 5 ° C или более от предполагаемого уставки. Поскольку вибрирующей колбе обычно перемешивают при фиксированной скорости, потребление кислорода и газообмен ограничено. Как только доступны окружающей среды кислород исчерпан, большинство культур не в состоянии процветать. Там нет никакого контроля рН в колбах. Во многих случаях, если культура не ограничивается сырья, становится кислым до точки ущерб культуре и дыхание резко замедляется. Большинство культур вибрирующей колбе также работать в качестве "партии", что означает, что они питаются только один раз на или вблизи начала культур inoculatioн. После этого первоначальный источник углерода потребляется, культура прекращает расти. В некоторых случаях его метаболизм может смещаться и начинают потреблять другие метаболиты в культуральном бульоне, иногда изменения характеристик полученного биомассы или белка. Колбах также обычно подлежат медиа потери испарения в теплых условиях культуры, как правило, 10% от объема, приходящегося на 24 часа при 37 ° С Эта потеря изменяет плотность культуры и запрещает длительный срок эксплуатации системы. Наконец, пользователь может столкнуться с пеной из средств массовой информации после агитации. Возникновение пены в приведенном выше культуре свободном пространстве будет ограничивать газообмен и дальнейший рост задушить.
Основная система ферментации предназначен для решения всех этих ограничений. Тщательный контроль температуры достигается в ферментационных сосудов с помощью крыльчатки перемешивания и нагревательной рубашкой. Датчик вставляется в емкость и обратной связи контроля нагрева и охлаждения этой куртке обычноРезультаты в температурного контроля ± 0,1 ° C вокруг уставки. Стационарные ферментеры как правило, обеспечивают контроль рН с помощью жидкостной того реагента через насос. Значение рН непрерывно контролируется в стремлении сохранить окружающую среду оптимальным для роста клеток. Правильное аэрации поддерживается вышеупомянутой смешивания рабочего колеса или с помощью инфузии воздух или кислород газа дополняться непосредственно в культуре. С сдвига чувствительных культур, кислород дополняется газ является основным механизмом для поддержания уровня кислорода в культуре. Измерение кислорода в растворе, как правило, достигается за счет полярографического зонда, который обычно не доступны для использования в колбах. Кроме того, можно непрерывно или периодически добавить канал в сосуд для поддержания роста в линейном или экспоненциальной форме. Выходящий газ конденсатор обеспечивает холодную поверхность для паров в потоке выхлопных газов для конденсации, таким образом, сохраняя объема культуры и плотность. Периодическое добавление противовспенивающего поверхностно приводитсяна датчик электропроводности в культуре, уменьшение пены на поверхности и позволяя газообмен.
Судно, со всеми зондами, фитинги, рабочие колеса, урожай трубы и трубки, собран и стерилизуют в стандартном автоклаве. После окончательного зонда калибровок и стабилизации к операционной среде, культура добавляется к судна. Затем система может быть использована, чтобы характеризовать культуру таким образом, что является более количественный и точным, чем с методом встряхивания флакона. Жесткий контроль температуры, рН, содержание кислорода, потребление корма, испарения жидкости и уровень пены способствуют гораздо более высокой биомассы и более высоким выходом белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stirred биореакторы бак являются стандартным в биотехнологической отрасли и были использованы на протяжении более 40 лет 1. Мешалкой Небольшой имело важное значение для МАСШТАБА, масштаб вниз, оптимизации деформации, описания, и процесс развития. Он также может играть важную роль в развитии индивидуального медицины 2. Мелкий масштаб биореактор, наиболее похожий на месте условий для роста клеток, потому что это можно контролировать и оптимизированы на протяжении пробега. Чаще всего, первые эксперименты выполняются с использованием колбах, но условия в малых масштабах биореакторе значительно отличаться от встряхивания флаконов. В одном эксперименте мы обнаружили, что условия для оптимального роста E. палочка и производство зеленого флуоресцентного белка (GFP) в вибрирующей колбе не перевести на перемешивающего резервуара (неопубликованные данные).
Другие методы выращивания клеток в больших масштабах включают роликовые бутылки, один Uсебе качающейся платформе биореакторы 3 и более крупные биореакторы одноразового использования с рабочими объемами от 50 до 5000 L. Каждый метод обеспечивает вызовы для его увеличения, но нашел место в производстве. Одноразовый биореактор качающейся платформе аналогична перемешивающего резервуара, и обеспечивает регулируемую среду. Он отличается от перемешивающего резервуара в этой перемешивания происходит за счет качания движение генерировать волны для предотвращения клеток оседание и обеспечивают кислородом. Гидродинамика для этого метода отличаются от перемешивающего резервуара и максимальный объем ограничен 1000 L. Различия могут повлиять на рост клеток и производство продукта. Другие системы одноразового использования сочетать с мешалкой с одноразовой реактора, обеспечить платформу с минимумом инфраструктуры и связанных с ними издержек, а также возможность для высокой пропускной Bioprocessing 4.
Новые пользователи настольных биореакторах могут иметь проблемы определения начальных уставки для рН, рО 2 и температурахтемпературы, однако опубликованных исследований можно ссылаться на эту информацию 5, 6, 7, 8, 9. С бактериальных культур, в частности, рекомендуется, чтобы начать перемешивание при той же скоростью, что и шейкер колбу и температуры, в то же заданного значения. Культура рН от предыдущих колбах трасс можно также использовать в качестве отправной точки. Установка значения рО 2 является более трудным и, как правило, определены эмпирически. Однако, начиная с 50% рО 2 является рекомендуемым отправной точкой.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержку в части Университета Джонса Хопкинса, Управлением Прово рамках Инициативы шлюза Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
Referencias
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
