تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية
Summary
وتستخدم Fermentors لزيادة الغلة الثقافة وإنتاجية الخلايا الهندسة البيولوجية. بعد فحص متعددة الميكروبية أو الحيوان المرشحين زراعة الخلايا في قوارير هزة، فإن الخطوة المنطقية التالية هي لزيادة الكتلة الحيوية الثقافة المحدد مع المخمر. يوضح هذا الفيديو الإعداد وتشغيل نظام مفاعل حيوي الفوق نموذجية.
Abstract
وتستخدم نظم التخمير لتوفير بيئة النمو الأمثل للعديد من أنواع مختلفة من الثقافات الخلية. القدرة التي يوفرها fermentors للسيطرة على درجة حرارة بعناية، ودرجة الحموضة، وتركيزات الأكسجين المذاب بشكل خاص يجعلها ضرورية لكفاءة النمو على نطاق واسع من المنتجات والتعبير التخمير. وهذا الفيديو وصف موجز للمزايا المخمر على قارورة هزة. فإنه سيتم أيضا تحديد المكونات الرئيسية لنظام التخمير الفوق نموذجية وإعطاء التعليمات الأساسية في الإعداد للسفينة ومعايرة تحقيقاتها. سيتم إطلاع المشاهد مع عملية التعقيم وأظهرت كيفية تطعيم المتوسطة النمو في السفينة مع الثقافة. كما سيتم أثبتت المفاهيم الأساسية للعملية، وأخذ العينات، والحصاد. كما سيتم مناقشة وتحليل البيانات بسيطة وتنظيف النظام.
Introduction
تكنولوجيا التخمير الأساسية هي امتداد لتقنية بسيطة هزة القارورة للثقافات النمو. أنها انبثقت من الرغبة في السيطرة على بيئات نمو الثقافات الحية بطريقة أكثر اكتمالا والكمي. دفعة قوارير الثقافة هزة تقتصر عادة عن طريق التحكم في درجة الحرارة غير دقيقة. التوحيد درجة الحرارة في شاكر المحتضنة غرفة دافئة أو متغير بدرجة كبيرة، وأحيانا الشرود 5 درجة مئوية أو أكثر من المضبوطة مسبقا المقصود. منذ يتم تحريكها القارورة هزة عادة بسرعة ثابتة، امتصاص الأوكسجين وغاز الصرف محدودة. مرة واحدة يتم استنفاد الأكسجين المحيطة المتاحة، معظم الثقافات تفشل لتزدهر. ليست هناك سيطرة درجة الحموضة في قوارير هزة. في كثير من الحالات، وإذا كانت الثقافة لا يقتصر بواسطة علف الماشية، ويصبح الحمضية إلى حد الإضرار الثقافة والتنفس يبطئ بشكل كبير. تدار معظم الثقافات هزة القارورة أيضا ك "دفعة"، مما يعني أن يتم إطعامهم مرة واحدة فقط عند أو بالقرب من بداية الثقافات inoculatioن. بعد يتم استهلاك هذا المصدر الكربون الأولي، يتوقف الثقافة المتنامية. في بعض الحالات قد ينتقل الأيض والبدء في استهلاك نواتج أخرى في مرق الثقافة، وأحيانا تغيير خصائص الكتلة الحيوية الناتجة أو البروتين. قوارير هزة هي أيضا عادة ما تخضع لفقدان التبخر وسائل الإعلام في البيئات الأكثر دفئا الثقافة، وعادة 10٪ من حجم في 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. هذه الخسارة يغير كثافة الثقافة ويحظر تشغيل طويلة الأجل للنظام. أخيرا، يمكن للمستخدم تواجه رغوة من وسائل الاعلام بعد الانفعالات. وحدوث رغوة في فراغ الرأس فوق ثقافة تحد تبادل الغازات وزيادة النمو خنق.
تم تصميم نظام التخمير الأساسية لمعالجة كل هذه القيود. ويتحقق التحكم في درجة الحرارة حذرا في الأوعية التخمير عن طريق استخدام التحريض المكره وسترة التدفئة. جهاز استشعار إدراجها في سفينة والسيطرة على ردود الفعل التدفئة والتبريد من هذه السترة عادةالنتائج في التحكم في درجة الحرارة ± 0.1 درجة مئوية في جميع أنحاء المضبوطة مسبقا. توفير fermentors الفوق عموما السيطرة على درجة الحموضة عن طريق إضافة كاشف السائل من خلال مضخة. ويتم رصد قيمة درجة الحموضة بشكل مستمر في محاولة للحفاظ على البيئة الأمثل لنمو الخلايا. يتم الاحتفاظ التهوية المناسبة عن طريق خلط المكره المذكورة أعلاه أو عن طريق ضخ الهواء أو الأكسجين تستكمل الغاز مباشرة في الثقافة. مع الثقافات الحساسة القص، والأكسجين غاز تستكمل هو الآلية الرئيسية لصيانة مستوى الأكسجين في الثقافة. وعادة ما يتحقق قياس الأكسجين في حل عن طريق مسبار البولاروجرافي التي لا تتوفر عادة للاستخدام في قوارير هزة. فمن الممكن أيضا أن أضيف بشكل مستمر أو بشكل دوري لتغذية السفينة للحفاظ على النمو بطريقة خطية أو الأسي. يوفر المكثف الغاز الخروج على سطح بارد لبخار في تدفق الغاز العادم لتتكثف، وبالتالي الحفاظ على حجم وكثافة الثقافة. بالإضافة الدوري للمضاد الرغوة السطحي هو دفعتهابواسطة مسبار الموصلية في الثقافة، والحد من الرغوة على السطح والسماح تبادل الغازات.
السفينة، مع كل تحقيقات، والتجهيزات، الضواغط، الأنابيب الحصاد، والأنابيب، يتم تجميعها وتعقيمها في الأوتوكلاف القياسية. بعد المعايرة نتائج التحقيق النهائي وتحقيق الاستقرار لبيئة العمل، يضاف إلى ثقافة السفينة. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم نظام لتوصيف الثقافة بطريقة أكثر دقة من الكمية وطريقة اهتزاز مع القارورة. رقابة مشددة من درجة الحرارة، ودرجة الحموضة ومحتوى الأكسجين، واستهلاك العلف، والتبخير السائل، ومستويات رغوة تسهم جميعها إلى الكتلة الحيوية أعلى من ذلك بكثير وأفضل محصول البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
المفاعلات الحيوية خزان أثارت هي المعيار في صناعة التكنولوجيا الحيوية واستخدمت لأكثر من 40 عاما 1. كان خزان صغير أثار مهمة لنطاق المتابعة، على نطاق أسفل، سلالة الأمثل، وتوصيف، وعملية التنمية. ويجوز لها أيضا دورا هاما في تطوير الطب فردية 2. مفاعل حيوي على نطاق صغير هو الأكثر مماثلة لفي ظروف الوضع الطبيعي لنمو الخلايا لأنه يمكن رصدها والأمثل طوال شوط. في معظم الأحيان، يتم تنفيذ التجارب الأولية باستخدام قوارير هزة لكن الظروف في مفاعل حيوي الصغيرة تختلف اختلافا كبيرا من القارورة هزة. في تجربة واحدة وجدنا أن ظروف النمو الأمثل للE. لم القولونية وإنتاج بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في قارورة يهز لا يترجم إلى خزان أثار (بيانات غير منشورة).
أساليب أخرى من الخلايا نموا في نطاق واسع تشمل زجاجات الأسطوانة، ش واحدحد ذاتها هزاز المفاعلات الحيوية منصة 3 والمفاعلات الحيوية ذات الاستخدام الواحد أكبر مع وحدات التخزين العمل من 50 إلى 5،000 L. كل أسلوب يوفر للتحديات النطاق، ولكن قد وجدت مكانا في الإنتاج. استخدام واحد هزاز منصة مفاعل حيوي يشبه خزان أثار، ويوفر بيئة منظمة. فهو يختلف من خزان أثار في هذا الخلط يحدث بسبب حركة هزاز لتوليد موجات لمنع تصفية الخلايا وتوفير الأوكسجين. والهيدروناميكا لهذا الأسلوب تختلف عن خزان أثار والحد الأقصى لحجم تقتصر على 1،000 L. يمكن للاختلافات تؤثر على نمو الخلايا وإنتاج المنتج. نظم استخدام واحدة أخرى تجمع بين الدبابة أثار مع المفاعل القابل للتصرف ل، وتوفير منصة مع حد أدنى من البنى التحتية والنفقات العامة المرتبطة بها، والقدرة على الإنتاجية العالية التجهيز البيولوجي 4.
المستخدمين الجدد من المفاعلات الحيوية الفوق قد يكون مشكلة في تحديد setpoints الأولية لدرجة الحموضة، ص 2 و تيماحلرارة، ولكن يمكن أن يكون مرجعا لبحث نشر هذه المعلومات 5، 6، 7، 8، 9. مع الثقافات البكتيرية على وجه الخصوص، فمن المستحسن أن تبدأ الإثارة في نفس السرعة كما القارورة شاكر ودرجة الحرارة في نفس المضبوطة مسبقا. ويمكن أيضا ثقافة الرقم الهيدروجيني من قوارير هزة السابقة أشواط أن تستخدم كنقطة انطلاق. تحديد قيمة ص 2 هو أكثر صعوبة وعادة ما يتم تحديد تجريبيا. ومع ذلك، بدءا من 50٪ بو 2 هو نقطة انطلاق الموصى بها.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا المشروع دعما جزئيا من قبل جامعة جونز هوبكنز، مكتب وكيل الجامعة من خلال مبادرة العلم عبارة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| ampicillin | Sigma | A1593-25G |
| LB broth | Sigma | L3022 |
| antifoam 204 | Sigma | A8311 |
| 1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
| Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
| Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
| pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
| 0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
| 0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
| Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
| Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
| Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
| 1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |
Referencias
- Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
- Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
- Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
- Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
- Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
- Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
- Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .
