عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر
Summary
وصفنا إعداد ثلاث عينات الاختبار وكيف يمكن استخدامها لتحسين وتقييم أداء المجاهر STORM. باستخدام هذه الأمثلة وتبين لنا كيفية الحصول على البيانات الخام ثم معالجته للحصول على الصور فائقة الدقة في خلايا حوالي 30-50 قرار نانومتر.
Abstract
STORM هو فائقة الدقة تقنية المجهر وضعت مؤخرا مع ما يصل إلى 10 مرات قرار أفضل من تقنيات مضان المجهري القياسية. لكن، وكما يتم الحصول على الصورة بطريقة مختلفة جدا من المعتاد، من خلال بناء صورة جزيء على حدة جزيء، وهناك بعض تحديات كبيرة للمستخدمين في محاولة لتحسين صورتهم الاستحواذ. من أجل مساعدة هذه العملية وكسب مزيد من التبصر في كيفية عمل STORM نقدم إعداد 3 عينات الاختبار ومنهجية لاكتساب ومعالجة STORM الصور فائقة الدقة مع قرارات نموذجية من بين 30-50 نانومتر. من خلال الجمع بين عينات الاختبار مع استخدام برامج معالجة متاحة بحرية عاصفة مطيرة فمن الممكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول جودة الصورة وحلها. استخدام هذه المقاييس فمن الممكن بعد ذلك لتحسين إجراءات التصوير من البصريات، لأخذ عينات من إعداد واختيار الصبغة، والظروف العازلة، والإعدادات الحصول على الصور. لديناعرض أمثلة ليسوتو لبعض المشاكل الشائعة التي تؤدي إلى سوء جودة الصورة، مثل الانجراف الجانبية، حيث يتحرك عينة خلال الحصول على الصور وكثافة المشاكل الناتجة في 'mislocalization "ظاهرة ذات الصلة.
Introduction
مؤخرا مجموعة من تقنيات المجهر الضوئي تم تطويرها، عادة ما يشار إليها باسم فائقة القرار المجهري أو nanoscopy، والتي يمكن تجاوز الحد الحيود وتوليد الصور مع قرارات 100 نانومتر أو أفضل 1،2. منذ إعلان فائقة الدقة المجهر بأنها طريقة طرق الطبيعة من السنة في عام 2008، كان هناك قدر كبير من تطوير المجاهر القائم على الترجمة. على سبيل المثال، هناك تطبيقات متعددة الألوان 3-6، 3D تطبيقات 7-12، وتطبيقات الخلايا الحية حتى 5،13-17. علاوة على ذلك، كما يتم تسويقها هذه الأنظمة ويتم الآن يشقون طريقهم للخروج من المختبرات والبصريات في أيدي علماء الأحياء الخلايا ومن المرجح أن تكون زيادة أخرى في استخدامها وتطبيقها على الأسئلة الطبية الحيوية هناك.
فرع واحد من هذه العائلة هو القائم على أساليب الترجمة التي تعمل عن طريق بناء صورة جزيء على حدة جزيء. أنان أجل القيام بذلك، يجب أن تنتقل غالبية الجزيئات الفلورسنت داخل العينة من ذلك أنه ليس هناك سوى عدد قليل من جزيئات تفصل مكانيا تنشط في أي وقت واحد. ثم يتم تبديل هذه الجزيئات بسرعة وخارجها، ويتم أخذ العديد من الصور بحيث يتم تصوير جزء كبير من السكان لتعكس البنية الأساسية بدقة الحيود الفرعية. تم نشر عدد من النهج بما في ذلك GSDIM 18، PALM 19، fPALM 20، 21 STORM وRESOLFT 22. ويمكن بعد ذلك الخوارزميات التي تقيس الموقف من الكشف عن جزيء واحد يمكن استخدامها لتحديد الموقف الفعلي للجزيء مع توضيحات أفضل من 20 نانومتر باستخدام المناسب جاوس 23، على سبيل المثال rapidSTORM 24،25 QuickPALM 26، palm3d 12 و 27 عاصفة مطيرة. عندما التصوير الخلايا أو العينات البيولوجية الأخرى، التي لديها كثافة جزيء عالية، وبالتالي من الضروري اتخاذ عدة آلاف من الأطرهذا وامض، مفصولة مكانيا، إشارة من أجل صورة نسبة كبيرة من الجزيئات المسمى.
مؤشر ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصرية (STORM) وdSTORM ارتباطا وثيقا وطرق GSDIM وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين، والتي ثبت للعمل مع الأصباغ العضوية متاحة تجاريا 21. ومنذ ذلك الحين أظهرت أنها قابلة للتطبيق على عدد من الأصباغ المختلفة 28-30، الأمر الذي يجعل من منهجية جاذبية خاصة نظرا لخصوصية والراحة النسبية لنهج immunolabeling راسخة لأداء مضان المجهري. وبالتالي، هناك سهولة الوصول إلى مجموعة واسعة من تقارن صبغ الأجسام المضادة وصبغ جزيء حيوي، والتي لديها القدرة على أن تستخدم في القائم على التعريب فائقة التصوير القرار. في حين أن المبادئ العامة للSTORM ونهج مماثلة هي بسيطة نسبيا، وأول وهلة الأجهزة وإعداد عينة يبدو سترا نسبياightforward، وهناك عدد من الخطوات في عملية والتي هي حاسمة لتحقيق جودة عالية، وخالية من القطع الأثرية والصور فائقة الدقة.
كما هو الحال مع جميع تقنيات الفحص المجهري يمكن اعتبار عملية في 3 خطوات رئيسية: أولا، إعداد العينات، والثانية، الحصول على الصور وثالثا، معالجة الصور و / أو تحليل الصور وتفسيرها. قوة إضافية حل وطريقة لتوليد الصور فائقة الدقة باستخدام النهج القائم على توطين يقدم بعض المشاكل والاعتبارات 31-33 جديدة. بدءا من إعداد العينات، وعند تنفيذ immunolabeling، ولا سيما المناعي غير المباشر حيث يتم استخدام مزيج الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وتجدر الإشارة إلى أن صبغة الفلورسنت قد يكون ما يصل إلى 20 نانومتر بعيدا عن جزيء من الفائدة. في حالة الأنابيب الدقيقة، وهذا يؤدي في أقطار من 35-50 نانومتر مقارنة مع قطر أنيبيب المتوقع من 25 نانومتر 28،30. أيضا، يجب أن كثافة وضع العلامات مEET المعايير نيكويست من أجل توليد صورة ذات جودة عالية 14. على سبيل المثال لدقة وضوح الصورة المتوقعة من 20 نانومتر إلى جانب هيكل الخيطية يجب أن يكون هناك جزيء الصبغة على الأقل كل 10 نانومتر 27. في حين تم نشر العديد من الأصباغ للعمل من أجل نهج قائم على توطين الأداء العام للصباغة هي مزيج من لا يقل عن أربعة معايير مهمة وهي الكشف عن الفوتونات في حالة التحول (سطوع كل طرفة – أكثر إشراقا هي أحسن)، والتوازن في خارج دورة العمل (على النقيض من نسبة الأصباغ في خارج مقابل على الدولة – أكثر من هو أفضل بشكل عام)، وجزء البقاء على قيد الحياة (معدل تبيض المنخفضة هي أحسن) وعدد من التحول دورات (عدد يومض في fluorophore – أكثر هو أفضل لارتفاع القرار، وعلى الرغم من أن وميض 1 في fluorophore يمكن أن يكون ميزة لأغراض العد جزيء). وتعقيد الوضع مزيدا من حقيقة أن هذه الخصائص لإعطاء أي صبغة يمكن أن تختلف في ظروف مختلفة عازلة ومع الليزر 28،29 السلطة. بالإضافة إلى ذلك، فضلا عن هذه الاعتبارات STORM فريدة من نوعها، ويمكن تحسين جودة الصورة من خلال تحسين إعداد العينات بنفس الطريقة عن تقنيات مضان المجهري أكثر تقليدية على سبيل المثال عن طريق تقليل تألق ذاتي من خلال تعديل شروط التثبيت واستخدام الكواشف التبريد. أيضا، والتقليل من fluorophores غير ملزمة على وجه التحديد هو المهم، الذي يمكن القيام به من خلال تعديل تركيزات التسمية، مرات الحضانة والحجب وغسل الخطوات.
الخطوة الثانية من الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية أيضا. سوف الإعدادات المثلى على المجهر تعتمد على الصبغة، والظروف العازلة، كثافة وضع العلامات، ونوع العينة، مثل الطبقات الوحيدة على الزجاج، والخلايا أو عينات الأنسجة. الاعتبارات الرئيسية هي الكاميرا وقت التعرض، ورقم الإطار، وزاوية الإضاءة (TIRF، HILO، برنامج التحصين الموسع) وقوة الليزر. الهدف هو جمع أكبر عدد ممكن مشرق يومض فصل مكانيا في أسرع وقت ممكن. إذا ط الخلفيةق عالية جدا أو يومض ليست مشرقة جدا، وبعبارة أخرى نسبة الإشارة إلى الضوضاء والفقراء، فإن خوارزمية إعادة الإعمار لن تكون قادرة على توطين الوظائف بأكبر. فضلا عن تعظيم الدقة التعريب، أي دقة مع كل موقف جزيء يمكن قياسها، جودة الصورة تعتمد أيضا على عدد كبير من تعريب. إذا تم تصويرها وجود العدد الكافي من الجزيئات من الفائدة، إما بسبب ضعف الكفاءة ووضع العلامات، photobleaching من الإفراط أو رقم الإطار غير كافية، ثم فائقة الدقة الصورة الناتجة ستكون منقط ومتقطع كما لن يكون قد تم الوفاء بمعايير نيكويست 14،27 .
وأخيرا، فإن الخطوة الثالثة، ومعالجة الصور، أهمية خاصة بالمقارنة مع تقنيات مضان المجهري القياسية. هناك مجموعة من بحرية ومتاحة تجاريا الخوارزميات، والتي هي على حد سواء ميزة، من حيث الاختيار، ووضع غير مؤات، لأنه يمكن أن يكون مربكا لمعرفة ث hich هو الأنسب للاستخدام. على سبيل المثال إذا البيانات الخام ومتباعدة بشكل جيد يومض متميزة مكانيا ثم واحدة جزيء المناسب خوارزمية يمكن أن تكون دقيقة وفعالة للغاية، على سبيل المثال عن طريق خوارزميات المناسب متفرق المتاحة في عاصفة مطيرة 27، 24،25 rapidSTORM، palm3d 12 و 26 QuickPALM البرمجيات . إذا كانت البيانات الخام يحتوي على الكثير من الإشارات المتداخلة ثم الخوارزميات التي قد تكون أكثر ملاءمة وتشمل DAOSTORM 34، 3B 35 و 36 deconSTORM. علاوة على ذلك، هذه الخوارزميات تتضمن عتبات معايير مختلفة مثل التهم إشارة، أو الفوتونات في طرفة، فضلا عن مختلف الخيارات المختلفة عرض الصور مثل تصور مع وظائف جاوس ممهدة أو رسوم بيانية مع شبكات بكسل، حيث حجم بكسل فائقة الدقة يمكن أن يكون المحددة من قبل المستخدم. كل من هذه الخيارات تغيير مظهر الصورة النهائية ويكون لها آثار على تفسير الصور وتحليلها.
<p class="jove_content"> ولذلك، فإننا نقدم 3 عينات الاختبار التي سوف توفر للمستخدم جديدة مع نقطة انطلاق لالمستندة إلى توطين التجارب قائم على الأصباغ فائقة القرار، الذي من أجل وضوح سنشير إليها STORM، والمستخدمين ذوي الخبرة الفرصة ل مزيد من تحسين تجاربهم. الأول، فمن الممكن أن معطف سطح الزجاج مع طبقة من الفلورسنت ديكستران صبغ المترافقة. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإثبات أن المجهر، وصبغ عازلة تعمل على توليد وامض إشارة الفلورسنت. ويمكن بعد ذلك طريقة تمديدها من خلال مقارنة متوسط الدقة توطين وعدد المقاييس التي تم إنشاؤها بواسطة عاصفة مطيرة لتحسين الظروف العازلة، ضبط الحصول على الصور واختبار الأصباغ المختلفة. الثانية، نقدم بروتوكول بسيط لإعداد خيوط الأكتين على الزجاج التي يمكن وصفها بسهولة باستخدام تقارن phalloidin صبغ. توفر هذه الهياكل مثالية لأخذ القياسات من القرار 27 وعادة العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM)من يعطى خيوط كتقدير التجريبية من القرار 37. تجدر الإشارة إلى أن القرار يختلف بين العينات وبين الصور داخل نفس العينة لأن القرار في القائم على التعريب فائقة القرار المجهري هي وظيفة من سطوع fluorophore، الضوضاء في الخلفية وكثافة توطين 27 وهذه ليست بالضرورة ثابتة طوال العينة. تستخدم خيوط الأكتين لإظهار القطع الأثرية المحتملة مثل mislocalizations والانجراف وكيف يمكن تحديدها مع ميزات البرنامج داخل عاصفة مطيرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام علامات إيمانية الفلورسنت لكل قياس والانجراف الصحيح. والثالث، يوصف تلطيخ الخلايا مع عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) تقارن صبغ. يوفر صندوق تعديل العولمة الأوروبي مؤشرا مفيدا لأداء صورة فائقة الدقة، وذلك لأن نسبة من مستقبلات على سطح الخلية يخضع الإلتقام عبر الحويصلات، والتي هي حيود شبه هياكل الحجم من حوالي 50-150 نم في القطر 27،38،39.Protocol
Representative Results
Discussion
وتبين لنا مع بعض عينات اختبار بسيط وبحرية المتاحة تجهيز عاصفة مطيرة البرمجيات فمن الممكن لتحسين STORM فائقة التصوير القرار. وهذه الأدوات والأساليب توفير نقطة انطلاق مفيدة للمستخدمين الجدد وطرق للمستخدمين ذوي الخبرة لزيادة الثقة في المجاهر واستخدامها منهم لدراسة البنيات البيولوجية والخلوية مع التفاصيل لم يسبق لها مثيل. باستخدام مزيج من عينات مع هياكل معروفة أو مفهومة جيدا وخوارزمية التي يمكن أن تنتج عددا من المفيد مقاييس جودة الصورة، مثل تقديرات الدقة متوسط، عدد التعريب ورسوم بيانية تظهر أنه من الممكن لتحسين جودة الصورة والحصول على قدر أكبر من الثقة في عملية التصوير STORM. ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع النهج إلى الحصول على البيانات كما أن هناك عددا من تكوينات مختلفة المجهر التجاري والذي يتم بناؤه ذاتيا التي يمكن استخدامها. وعلاوة على ذلك، هناك العديد من إعداد العينات وصورة الخطوات التي يمكن الاستحواذ influجربت بالتالي فإن الصورة النهائية لها أدوات البرمجيات واختبار عينات أمر بالغ الأهمية لفهم وتحسين جودة الصورة STORM.
بالإضافة هذه البروتوكولات يمكن أن توفر وسائل مفيدة وأقل غموضا من أي استكشاف المشكلات التي قد تنشأ. على سبيل المثال العينة ديكستران هو وسيلة مفيدة جدا لتحديد إذا كان هناك أي اختلال شعاع الليزر أو الإضاءة غير المتكافئ للالعينة. إذا كانت هناك مخاوف من أن المخزن المؤقت التحول قد لا تعمل اختبار بصرية بسيطة جدا لمعرفة ما إذا كان هناك أي و'امض' مساعدة. خيوط الأكتين هي طريقة مفيدة لقياس القرار باستخدام مقارنات FWHM فضلا عن تسليط الضوء على الانجراف وmislocalization التحف. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن وسائل فائقة الدقة على أساس التوطين يمكن أن يكون كثافة fluorophore الحساسة، وبغض النظر عن العوامل المساهمة الأخرى، مثل التعرض مرات، ومعدلات الإطار، القوى الليزر والطريقة تتم معالجة الصورة، فمن المستحيل لتعيين قرار لالمجهر معين ونفترض أن جميع الصور سوف يكون هذا القرار. ما هو ممكن، ولكن هو لقياس الجوانب المختلفة للقرار مثل توضيحات يعني التوطين، توطين عدد 27 والانجراف. حتى لو لم يمكن إدراج علامات إيمانية في كل تجربة ما في وسعهم، على الأقل، يمكن استخدامها لوصف نظام المجهر، والبيئة، وفهم أفضل الاعتبارات التشغيلية مثل كيفية مطلوب الكثير من الوقت للوصول إلى التوازن الحراري بعد بدء التشغيل. وكذلك تصحيح الانحراف الجانبي لل، علامات إيمانية يمكن استخدامها لتوصيف والصحيح لالانجراف المحوري، رغم أن هذا يتطلب استخدام عدسة اللابؤرية وآلية التقييم لتصحيح موقف العينة في حين أن الصور يتم الحصول عليها 43. وسوف تشمل أنظمة فائقة الدقة التجارية عادة نوعا من السيطرة على الاستقرار أو التركيز قفل آلية، والتي قد يكون حلا أكثر عملية لتصحيح الانحراف التركيز.
هناكإعادة بدائل لطلاء وجه التحديد غير الزجاج مع ديكستران، مثل استخدام الأصباغ مباشرة أو الجزيئات المكورات أخرى، مثل الأجسام المضادة الثانوية. وجود قيود على هذه النهج هو أن عدد الجزيئات بد أن الزجاج غير معروف. هياكل الخيطية البديلة التي استخدمت تشمل الأنابيب الدقيقة 28 والحمض النووي 21. ومع ذلك، فإن الجمع بين حجم صغير جدا ومريحة الكواشف المتاحة تجاريا جعل الأكتين بديلا جذابا، خاصة أن مسافة الفصل بين شعيرات المتباينة أو متفرعة يمكن أن يكون أيضا من المفيد قياس أداء النظام 27.
هناك مجالا لمزيد من عينات الاختبار التنمية، على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في هذا المجال 28،29،46،47. على وجه الخصوص، يقدم التصوير متعدد الألوان عددا من التحديات في جميع الجوانب الرئيسية 3 من التصوير، ووضع العلامات العينة، الحصول على الصور (الأجهزة)، وبرنامج (معالجة الصور والمحاذاة). لقد كان هناك لعدد من المنشورات معالجة هذه الجوانب 4-6 وبالتالي فمن الواضح أن العينات واختبار المنهجيات المناسبة حاسمة لتوليد وتفسير موثوق هذه الأنواع من الصور. في الواقع، في الآونة الأخيرة تبين أن dSTORM يمكن استخدامها لاتخاذ صورتين لون، ولحل، وطبيعة متناظرة للغاية من مجمع المسام النووية واقترح المؤلفان أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة مثالية لتقييم أداء تصويبات انحراف لوني 45. نهج آخر للاهتمام هو استخدام اوريغامي الحمض النووي لإنشاء nanoruler، مما يخلق إمكانية fluorophores المواقع على مسافات حيود فرعية محددة بصرف النظر 46. وهذا يوفر وسيلة لتقييم القرار وصنع قياسات المسافة. ومع ذلك، فإن الهدف النهائي هو تطبيق هذه التقنيات فائقة الدقة لعينات غير مثالية، مثل الخلايا، والتي هي معقدة هياكل ثلاثية الأبعاد. في هذه الحالة، وهو مزيج من أكثر فهم دقيق لرانه أسلوب جنبا إلى جنب مع أدوات البرمجيات التي تساعد المستخدم في الحصول على البيانات ومعالجتها بالطرق المناسبة، وتوفير مقاييس الصورة من المرجح أن يكون الجواب النهائي. 28،29،47،48
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف التمويل من البرنامج الكيميائية والبيولوجية المقاييس من مكتب الوطني للقياس في المملكة المتحدة. نشكر سيباستيان فان دي ليندي، ميكلوس Erdelyi واريك ريس للحصول على المشورة والاقتراحات الفنية. نشكر ميكلوس Erdelyi، اريك ريس وماكس Ryadnov للتعليقات مفيدة والمناقشات حول هذا المخطوط.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
| 100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
| EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
| 640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
| LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
| ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
| Table 1. Materials & Equipment | |||
| [header] | |||
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Table 2. Reagents |
Referencias
- Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
- Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
- Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
- Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
- York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
- Jones, S., Shim, S. -. H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
- Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
- Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
- Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
- Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
- Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
- Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12 (2012).
- Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
- Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
- van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
- Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457 (2012).
- Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
- Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
- Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
- Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
- Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
- van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
- Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
- Heilemann, M., Mukherjee van S, ., A, M., Sauer, Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
- Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
- Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
- Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
- Laevsky, G. S., O’Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20 (2013).
- Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).
