Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em> Drosophila</emMotion> Larva
Summary
Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol açıklar<em> Drosophila</em> Geleneksel bir konfokal mikroskop içinde lazerler kullanarak larva. Bu teknik, motorun devrelerin dinamiklerini aydınlatmak için birkaç neuromeres nöral aktivitenin yerel pertürbasyon elde etmek için araştırmacılar sağlar.
Abstract
Drosophila larva hareket 1-6 devrelerde temel nöronal bileşenlerin genetik erişilebilirlik sayesinde gelişimsel ve fizyolojik nörobilim görkemli bir model sistem vardır. Larva sinir devresinde optogenetics 7,8 uygulanması bize mekansal ve zamansal desenli şekilde 9-13 nöronal aktivite değiştirmenize olanak verir. Tipik olarak, numuneler geniş bir cıva lambası ile aydınlatılmış ya da LED vardır, hedef nöronları çok özgünlüğü, Gal4 UAS sistemi 14,15 gibi ikili gen ifade sistemi ile kontrol edilir. Bu çalışmada, "alt-genetik çözünürlük" için uzaysal çözünürlüğü geliştirmek için, biz yerel geleneksel bir konfokal mikroskop uygulanan lazerler kullanarak ventral sinir kablosu nöronların bir alt kümesi aydınlattı. Yarı sağlam larvaların vücut duvarı hareketini takip ederken, etkileşimli aktif veya channelrhodopsin 16,17 o ile sinirsel aktivite inhibesırasıyla r halorhodopsin 18-20,. Sinir dokusunun mekansal ve zamansal olarak sınırlı aydınlatma, biz davranış belirli bir aşamasında devre belirli nöronların aktivitesini işleyebilirsiniz. Bu yöntem, ventral sinir kablosu bir lokal sinir düzeneği ve motor çıkış uzaysal desen faaliyetleri arasındaki ilişkiyi çalışmak için yararlıdır.
Introduction
Drosophila larvaları ileri peristaltik hareket anterior segment posterior gelen kas kasılması yayılması ile oluşur. Bu hareket, uzunlamasına gövde ekseni boyunca ventral sinir kablosu olan motor nöron sıralı aktivasyonu ile gerçekleştirilir. Bu desenli yayılan etkinlik arkasındaki devre incelemek için, nöral aktivitenin yerel pertürbasyon bilgilendirici bir yaklaşım olabilir. Farmakolojik tahlil sinir dokusu gibi belirli bir nörotransmitter olarak madde, kontrol rağmen larva ventral sinir kablosunun boyuna ekseni boyunca benzer neuromeres oluşan tekrarlanan yapı olduğu için, farmakolojik ilaçların etkisi hemen hemen tüm kesimleri arasında benzer olabilir. Alternatif olarak, tek bir segment az sayıda Optogenetic veya ısıya duyarlı prob molekülleri ifade olabilir. Bununla birlikte, bu tür özel Gal4 hatları oluşturmak için çok zordur. Burada birkaç seg nöronların işlemek için bir yöntem mevcutlazer aydınlatma kullanarak ments. Konfokal mikroskopi mekansal sınırlı aydınlatma yararlanarak, bir bir yerel alan nöronların aktivitesini karıştırmayı olabilir. Nöron spesifik gal4 hatlarının alt tarafından prob ifade desen ile birlikte, bu lazer aydınlatma yöntemi büyük ölçüde pertürbasyon için uzaysal çözünürlüğü artırır. Bu yöntem, sadece geleneksel bir konfokal mikroskop gerektirdiğinden ve ek laboratuar ekipmanları satın tipik olarak gerekli değildir.
Bu tekniği kullanarak, motor çıkışı 13 ve yayılma esnasında motor nöron aktivitesi rolü incelenmiştir. Peristaltik hareket sırasında birkaç segment içinde motor nöronların faaliyetlerini engelleyerek, biz motor nöronların kendilerini faaliyet motor çıkış sinyalinin yayılması için gerekli olup olmadığını test etmek için başardık. Motor nöronların yerel ve geçici abluka peristaltik hareket yayılma tutuklandı. Blokajı uzaklaştırıldıktan sonra, propagation dalga tutuklanan segment ortaya çıktı. Bu olgu, motor nöronu aktivasyonsuz propagative dalga başka ventral sinir kord boyunca ilerleme olamaz olduğunu göstermektedir ve bu nedenle motor nöronların aktivasyonu peristaltik hareket için gereklidir. Biz daha önce Inada ve arkadaşları. (2011) 13 ayrıntılı veriler ve bu fenomen hakkında tartışmalar bildirdin. Burada, biz disseke larvaların hareket izlerken interaktif sinirsel etkinlik karıştırmayı için yöntem açıklanmaktadır. Çeşitli gal4 hatları ve aktivite manipülasyon için uzaysal desen dizi kullanarak, bir motorun devre pertürbasyon yanıt özellikleri ile devre mantığı araştırabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöral aktivitenin zamansal ve yerel pertürbasyon nöral devrelerin ağ dinamiklerini analiz etmek için paha biçilmez bir tekniktir. Bu protokol, bir lazer kullanarak optogenetics ile sinirsel aktivite işlemek için bir yöntem mevcut. Lazer yüksek yön cıva veya Xenon lamba kullanarak geniş alan stimülasyonu daha lokalize optogenetic stimülasyon sağlar. Lazer aydınlatma daha önceki çalışmalarda optogenetics uygulanmış olmasına rağmen, bu tür cam elyaf, mikromanipülatör ve lazer kaynağı, gibi özel kurulumları en önceki çalışmalarda gereklidir. Bu protokol, yerel aydınlatma için geleneksel bir konfokal mikroskobu kullanın. Konfokal mikroskop sistemi yaygın olarak kullanıldığı için, bu yöntem birçok laboratuvarlarında yüksek çözünürlük optogenetics uygulama fırsatı açılacaktır.
Larva diseksiyonu ve lazer güç: Protokol iki kritik nokta vardır. İlk olarak, beyin, ventral sinir kablosu veya motor sinir Duri bozuksang diseksiyonu, larva az sergilemek ya da hiç kendiliğinden peristaltik hareket olacaktır. Hassas yaylı makas ile sırt tarafında bir kesi yapmak ve forseps ile iç organların çıkarılması, özellikle de bu nedenle önemlidir. Diseksiyonu ilgili ayrıntılar daha önce 21 bildirilmiştir. İkincisi, eğer yeterli uyarım, yaklaşık 0.1 bir lazer gücü ~ ChR2 veya 1 NpHR için ~ 10 mW / mm 2 'gereklidir boyunca 1 mW / mm 2' ulaşılacak. Biz aydınlatma tahmini alanına bölünmesiyle objektif lens altında toplam hafif güç olarak lazer güç değerlendirilmiştir. Biz bir güç ölçer (mobiken, Sanwa MI Technos, Japonya) kullanılarak toplam ışık gücü ölçülmüştür. Biz dairesel sabit kez kabaca kırınım sınırı ışıklı alanı veren lazer dalga boyu, karesi olarak aydınlatma alanında tahmin. Örnek üzerinde etkili aydınlatma gücü tarama hızı ve uyuşmuş değiştirerek de lazer çıkış gücü ile sadece ayarlanabilir, ama olabilirtekrar er. Biz 63 kez 20-100 mikrosaniye / piksel ile lazer taraması yapmıştır. Buna ek olarak, optogenetik protein ve ATR miktarı ifade seviyesi, aynı zamanda verimlilik uyarılması için kritik öneme sahiptir. Lazer gücü (mikroskop sistemi optimize ederek), 2) optogenetics protein ekspresyon seviyesi (genotip ve yetiştirme sıcaklığı kontrol ederek), ve 3) miktarı: 1) larvaları yok optogenetic tepki gösterdi Buna göre, aşağıdaki noktaları kontrol ve düzeltilmelidir ATR (ATR konsantrasyonu ayarlama ve dönem besleyerek). NpHR 13 bilinmeyen nedenlerle ChR2 göre daha ATR yüksek konsantrasyon gerektirir. ChR2 burada açıklanan daha az ATR (örneğin 0.1 mM) (1 mM) içeren gıda yetiştirilen larva iyi çalışır. 1 mM ATR için larva besleme ChR2 fotoğraf reaktif yapmak için yeterli olduğu gibi, biz ChR2 deneylerde ilk deneme için bu konsantrasyon tavsiye. ATR konsantrasyonu, daha sonra, 1 mM aşağı titre edilebilir. ATR için maruz kalma süresi ile ilgili olarak, öneririzsüresi sağlam optogenetic kontrolü için burada açıklanan. Biz sık sık kısa süreli için ATR için larva beslerken optogenetic yanıt gözlemlemek için başarısız oldu.
Bu protokol, lazer aydınlatma ve görüntü elde etme ayrı bir bilgisayar tarafından işletilmektedir. Yani, CCD kamera tarafından lazer aydınlatma uzaysal desen net algılama veri analizi için önemlidir. Lazer nokta veya çizgi CCD görüntü loş ise, halojen lamba ve vücut duvarı görünür tutarken lazer aydınlatma görselleştirmek için CCD kamera kazanç değerini gücünü optimize gerekir.
Bu protokolde gösterilen Spatiotemporal aydınlatma larva motor devreleri hakkında bilgi verir, ancak yöntem bazı sınırlamalar vardır. Olarak "mekansal" yönü, aydınlatma yeri vücut duvarı hareketleri videoya için kullanılan düşük büyütme CCD görüntü tarafından kaydedilir. Buna göre, aydınlatma alanı hücresel düzeyde segmenti düzeyinde atanan, ancak olabilir. "T itibarıylaLazer ile konfokal mikroskop ve aydınlatma ile lazer tarama geçiş arasında emporal "yönü, zaman farkı konfokal mikroskop sistemi ve tarama durumuna bağlıdır. Sonuç olarak, deneme yanılma ile bazı test aydınlatma zamanlama ayarlamak için gereklidir. aydınlatma zamanlaması olabilir beri ImageJ gibi yeterli yazılım kullanarak CCD görüntü filmlerde belirlenecek, zamansal çözünürlükte kritik bir faktör CCD kamera görüntüleme çerçeve oranıdır. Biz genellikle saniyede 7.5-15 kare için kare hızını ayarlamak.
Optogenetic araçları gelişmeler bize bu protokolü değiştirmek için bir şans sağlar. Biz 3 instar OK6-Gal4 sahip larva ve UAS-ChR2 [H134R] veya UAS-NpHR2 kullanılır. Yerine ChR2 Diğer optogenetic araçları [H134R] veya NpHR2 gibi ChR2 gibi [T159C/E123T], NpHR3 veya Arch faaliyet kontrolü 22 verimini artırabilir. Buna ek olarak, diğer gal4 hatlarını kullanarak ya da diğer gelişimsel aşamada analiz motor circui hakkında daha fazla bilgi verebilirts.
Bu protokol, motor aktivite bir CCD kamera ile bodywall daralma iletim görüntüleri ile izlenmiştir. ChR2 veya NpHR ile sinir aktivitesi işlenirken kalsiyuma duyarlı fluoresan moleküller (örneğin GCaMP) ile motor nöron aktivitesi aynı zamanda doğrudan izlenebilir. Bu durumda, geniş bir alanı ve son derece hassas bir CCD kamera (örneğin EMCCD kamera) mavi ışık, aydınlatma, bir halojen lamba yerine kullanılabilir ve normal CCD kamera, burada daha önce tarif edilmiştir. Düşük büyütme lens ile örnek ve izleme bodywall yukarıdan bir yüksek büyütme objektif lens (örneğin 40x) ile ventral sinir kablosunun aydınlatma: ek objektif lens kullanarak izleme bodywall hareketi, daha gelişmiş bir yöntem olabilir iken stimülasyon uzaysal çözünürlüğü artırmak için (örneğin 4x) örneği aşağıda. Bu çift lens sistemi bize daha yüksek uzaysal çözünürlükte sinir sistemini uyarmak için izin verebilir.
<p class="Jove_content"> Burada gösterilen protokol, diğer sinir devreleri uygulanabilir, Resim Optogenetic araçları sinir sisteminde ifade edilebilir ve yeterli ışık nöral dokuya teslim edilebildiği içerisinde preparasyon kurulabilir.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Yenilikçi Alanlar Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir "Mezoskopik Neurocircuitry" (No 22.115.002) ve Eğitim, Kültür, Spor, Bilim Bakanlığı "Kapsamlı Beyin Bilim Ağı" (No 221S0003), ve Teknoloji, Japonya AN ve Grant-in-Aid Bilim Teşvik Japonya Derneği Genç Bilginler için (B) (No 21.700.344) (JSPS) HK ile
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
| CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
| all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
| Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |
Referencias
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
- Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
- Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
- Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
- Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
- Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
- Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
