הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em> דרוזופילה</em> זחלים בתנועה
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא פגע<em> דרוזופילה</em> זחלים באמצעות לייזרים במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג הפרעות מקומית של פעילות עצבית בכמה neuromeres להבהיר את הדינמיקה של מעגלים מוטוריים.
Abstract
תנועת הזחל דרוזופילה היא מערכת מפוארת מודל במדעי המוח התפתחותית ופיסיולוגיים, מכוח הנגישות הגנטית של הרכיבים העצביים הבסיסיים במעגלים 1-6. יישום של optogenetics 7,8 במעגלים העצביים הזחל מאפשר לנו לתפעל את הפעילות עצבית בדרכים 9-13 בדוגמת מרחב ובזמן. בדרך כלל, דגימות מוארים באופן רחב עם מנורת כספית או LED, ולכן הספציפיות של הנוירונים היעד נשלטת על ידי מערכות ביטוי גנים בינאריות כגון מערכת Gal4-כטב"מ 14,15. בעבודה זו, על מנת לשפר את הרזולוציה המרחבית ל" רזולוציה משנה גנטית ", אנו באופן מקומי מוארים משנה של תאי עצב בחוט עצב הגחון באמצעות לייזרים שיושמו במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. תוך מעקב אחר התנועה של קיר הגוף של הזחלים למחצה ללא פגע, אנו אינטראקטיביים מופעלים או עכבות פעילות עצבית עם channelrhodopsin 16,17 Or 18-20 halorhodopsin, בהתאמה. על ידי תאורה מוגבלת מרחב ובזמן של הרקמה העצבית, אנחנו יכולים לתפעל את הפעילות של תאי עצב מסוימים במעגל בשלב מסוים של התנהגות. שיטה זו שימושית לחקר הקשר בין הפעילות עצבית הרכבה מקומית בחוט עצב הגחון ודפוס spatiotemporal תפוקת מנוע.
Introduction
תנועה קדימה peristaltic בזחלים תסיסנית מתרחשת על ידי ההפצה של התכווצות שרירים מאחוריים למגזרים קדמיים. תנועה זו מתממשת על ידי הפעלה רציפה של הנוירונים מוטוריים בחוט עצב הגחון לאורך ציר אורך הגוף. כדי לבחון את המעגלים מאחורי פעילות הפצת דוגמת זו, הפרעות מקומית של פעילות עצבית יכולה להיות גישה אינפורמטיבי. למרות assay התרופתי יכול לשלוט בחומר מסוים, כגון מוליכים עצביים, ברקמה עצבית, ההשפעה של תרופות תרופתיות יכולה להיות דומה בין המגזרים, כי כמעט כל חוט עצב הגחון הזחל הוא מבנה חוזר על עצמו מורכב מneuromeres דומה לאורך ציר האורך. לחלופין, אפשר להביע optogenetic או מולקולות בדיקה רגישות טמפרטורה במספר קטן של מגזרים. עם זאת, Gal4 קווים ספציפיים כאלה קשים מאוד לייצר. כאן אנו מציגים שיטה למניפולציה בתאי עצב מעטים צינוקments באמצעות תאורת לייזר. ניצול של התאורה מרחבית מרותק במיקרוסקופיה confocal, אפשר לטרוד את הפעילות של תאי עצב באזור מקומי. בשילוב עם דפוס הביטוי של החללית על ידי תת קבוצות של Gal4 קווי נוירון ספציפיים, שיטת תאורת לייזר זה משפרת באופן משמעותי ברזולוציה מרחבית להפרעות. ומכיוון ששיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, רכישת ציוד מעבדה נוספת שלו בדרך כלל לא הכרחית.
שימוש בטכניקה זו, בדקנו את התפקיד של פעילות עצבית מוטורית במהלך ההתפשטות של מנוע פלט 13. על ידי חסימת פעילותם של הנוירונים מוטוריים בתוך כמה מגזרים בזמן תנועת peristaltic, היינו יכול לבחון האם הפעילות של תאי עצב מוטוריים עצמם נדרשת להתפשטות של אות הפלט המוטורית. מצור מקומי וזמני של הנוירונים מוטוריים נעצר ההתפשטות של תנועת peristaltic. לאחר המצור הוסר, פרוpagation הופיע בקטע שבו הגל נעצר. תופעה זו מצביעה על כך שללא הפעלה עצבית מוטורית, גל propagative לא יכול להתקדם לאורך חוט עצב הגחון הלאה, ובכך ההפעלה של מנוע הנוירונים היא הכרחית לתנועת peristaltic. יש לנו דיווח נתונים ודיונים על תופעה זו מפורטים בעבר בInada et al. (2011) 13. כאן, אנו מתארים את השיטה כדי לטרוד פעילות עצבית אופן אינטרקטיווי תוך מעקב אחר התנועה של הזחלים גזורים. שימוש Gal4 קווים וסדרה של דפוסי spatiotemporal למניפולצית פעילות שונים, אפשר לחקור היגיון מעגלים דרך תזזית מאפייני תגובה של מעגל המנוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרעות זמנית ומקומיות של פעילות עצבית היא טכניקה לא יסולא בפז לניתוח דינמיקת הרשת של מעגלים עצביים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לתפעל את הפעילות עצבית על ידי optogenetics באמצעות לייזר. יווני גבוהות של לייזר מאפשרת גירוי optogenetic מקומי יותר מגירוי שדה הרחב באמצעות כספית או קסנון מנורה. למרות תאורות לייזר כבר הוחלו optogenetics במחקרים קודמים, מערכים מיוחדים כגון סיבי זכוכית, micromanipulator, ומקור לייזר, נדרשים במחקרים הקודמים ביותר. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במיקרוסקופיה confocal קונבנציונלית לתאורה מקומית. מאז הוא משמש את מערכת מיקרוסקופ confocal נרחבת, שיטה זו תפתח את ההזדמנות ליישם optogenetics ברזולוציה גבוהה יותר במעבדות רבות.
יש הפרוטוקול שתי נקודות קריטיות: נתיחת הזחל וכוח לייזר. ראשית, אם המוח, חוט עצב הגחון או עצב מוטורי פגום דורינתיחת נג, הזחלים יפגינו פחות או תנועה ספונטנית peristaltic אף אחד. Precision לכן חיוני, במיוחד בעת ביצוע חתך בצד הגבי עם מספריים באביב והסרה איברים פנימיים עם מלקחיים. פרטים על הנתיחה כבר דווחו בעבר 21. שנית, אם גירוי מספק הוא להיות מושגת, כוח לייזר של כ 0.1 ~ 1 mW / 2 מ"מ או 1 לChR2 נדרש ~ 10 mW / 2 מ"מ לNpHR. הערכנו את כוח לייזר ככולל כוח האור מתחת לעדשה אובייקטיבית מחולקת בשטח מוערך של תאורה. אנחנו נמדדים כולל כוח האור באמצעות מד כוח (mobiken, Sanwa MI Technos, יפן). הערכנו את השטח של תאורה כקבועות פעמים חוזרים רבועות של אורך הגל של לייזר, אשר בערך נותן שטח מואר בגבול השתברות. כוח התאורה אפקטיבי על המדגם יכול להיות מותאם לא רק על ידי כוחו של פלט לייזר, אלא גם על ידי שינוי המהירות ותחושת הסריקהאה של חזרות. אנחנו סרקנו לייזר עם 20-100 פיקסל μsec / ל63 פעמים. בנוסף, רמת הביטוי של חלבון optogenetics והסכום של ATR הן גם קריטית ליעילות גירוי. בהתאם לכך, אם זחלים לא הראו תגובת optogenetic, יש לבדוק את הנקודות הבאות ותיקן: 1) כוח לייזר (על ידי אופטימיזציה של מערכת מיקרוסקופ), 2) רמת ביטוי של חלבון optogenetics (על ידי בדיקת גנוטיפ וטמפרטורת גידול), ו 3) הסכום של ATR (על ידי התאמת ריכוז של ATR ומאכיל את התקופה). NpHR דורש ריכוז גבוה יותר של ATR מאשר ChR2 עושה על ידי 13 מסיבות לא ידועות. ChR2 עובד היטב בזחלים גודלו במזון המכיל פחות ATR (לדוגמה 0.1 מ"מ) מאשר שתואר כאן (1 מ"מ). כהאכלת זחלים לATR 1 מ"מ מספיק להכנת ChR2 צילום תגובתי, אנו ממליצים לריכוז זה המשפט הראשון בChR2 ניסויים. הריכוז של ATR לאחר מכן ניתן טיטרציה למטה מ 1 מ"מ. מבחינת משך חשיפה לATR, אנו ממליציםהמשך מתואר כאן לבקרה חזקה optogenetic. לעתים קרובות אנו לא הצלחנו להתבונן תגובת optogenetic כאשר האכלת זחלים לATR למשך זמן קצר יותר.
בפרוטוקול זה, תאורת לייזר ורכישת תמונה המופעלות על ידי מחשב נפרד. לכן, זיהוי ברור של דפוס spatiotemporal של תאורת לייזר על ידי מצלמת CCD הוא קריטי לניתוח נתונים. אם כתם לייזר או קו הוא עמום על תמונת CCD, אתה צריך לייעל את כוחה של מנורת הלוגן וערך רווח של מצלמת CCD לדמיין את תאורת לייזר, תוך שמירה על קיר גוף גלוי.
תאורת spatiotemporal שמוצגת בפרוטוקול זה מספק מידע על מעגלים מוטוריים זחל, עם זאת, יש כמה מגבלות השיטה. אשר להיבט "מרחבי", המיקום של התאורה שתועד על ידי תמונת CCD ההגדלה נמוכה המשמשת לצילום וידאו תנועות גוף קיר. בהתאם לכך, ניתן להקצות שטח תאורה ברמת מגזר, אבל לא ברמה תאית. באשר ל" לא"היבט, פער זמן בין emporal מיתוג על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal ותאורה על ידי לייזר תלוי במערכת מיקרוסקופ confocal ומצב סריקה. כתוצאה מכך, כמה בדיקות על ידי ניסוי וטעייה נדרשת כדי להתאים את תזמון תאורה. מאז העיתוי של הארה יכול ייקבע בסרטי CCD תמונה באמצעות תוכנה מתאימה כמו ImageJ, הגורם הקריטי בהחלטה זמנית הוא במסגרת שיעור של מצלמת CCD הדמיה. אנחנו בדרך כלל להגדיר את המסגרת דולר ל7.5-15 פריימים לשנייה.
התקדמות בכלים optogenetic לספק לנו הזדמנות לשנות את הפרוטוקול זה. אנחנו השתמשנו 3 rd זחלי instar בעל OK6-Gal4 וכטב"מ-ChR2 [H134R] או כטב"מ-NpHR2. כלים optogenetic אחרים במקום ChR2 [H134R] או NpHR2 כגון ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 או קשת יכולה להגביר את היעילות של השליטה בפעילות 22. בנוסף, באמצעות Gal4 קווים אחרים או ניתוח בשלבי התפתחות אחרים יכול לספק מידע נוסף על המנוע circui TS.
בפרוטוקול זה, פעילות המוטורית הייתה פיקוח על ידי תמונות שידור של התכווצות bodywall עם מצלמת CCD. הפעילות של הנוירונים מוטוריים הקרינה עם מולקולות סידן רגישות (למשל GCaMP) יכולה גם להיות במעקב באופן ישיר תוך מניפולציה פעילות עצבית עם ChR2 או NpHR. במקרה זה, תאורת אור כחולה באזור רחב ומצלמת CCD רגישה מאוד (EMCCD מצלמה למשל) משמשות במקום מנורת הלוגן ומצלמת CCD הרגילה שתוארה קודם לכן במסמך זה. כדי לשפר את הרזולוציה המרחבית של גירוי תוך תנועת bodywall ניטור, תוך שימוש בעדשת מטרה נוספת עשויה להיות שיטה מתקדמת יותר: תאורה של חוט עצב הגחון על ידי עדשה אובייקטיבי ההגדלה גבוהה (למשל 40X) מלמעלה ומדגם bodywall ניטור על ידי עדשת ההגדלה נמוכה (לדוגמה: 4x) להלן המדגם. מערכת עדשות כפולה זה עשויה לאפשר לנו לעורר את מערכת עצבים ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר.
<p class="Jove_content"> הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם על מעגלים עצביים אחרים, יכולים לבוא לידי ביטוי כלים optogenetic ניתנים במערכת העצבים, וניתן להקים בי הכנה מספיק אור יכול להיות מועברת לתוך הרקמה העצבית.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט-in-Aid למחקר מדעי בתחומים חדשניים "Mesoscopic Neurocircuitry" (מס '22,115,002) ו" מקיף ברשת מדעי המוח "(מס 221S0003) של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, וטכנולוגיה, יפן ולגרנט-in-Aid למדענים צעירים (ב) (מס '21,700,344) של יפן האגודה לקידום המדע (JSPs) HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
| CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
| all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
| Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |
Referencias
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
- Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
- Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
- Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
- Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
- Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
- Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
