胰蛋白酶精华协议分析视网膜血管小鼠模型
Summary
胰蛋白酶的消化是一个最常用的方法来分析视网膜血管。这份手稿中详细介绍的方法，包括关键的改动，优化技术，并删除无血管组织，同时保持整体架构的船只。
Abstract
胰蛋白酶消化的金标准方法来分析视网膜血管1-5。它允许对整个网络的可视化的复杂的三维视网膜血管和通过创建一个二维的平面安装的血管通道互连消化后的非血管成分的视网膜毛细血管。这使得一个研究各种病理血管的变化，如微血管瘤，毛细血管变性，内皮细胞异常周细胞比率。然而，该方法在技术上具有挑战性的，特别是在老鼠，这已成为最广泛使用的动物模型来研究视网膜因为遗传操作便于6,7。在小鼠眼，这是特别困难的，以完全除去非血管的组件，同时保持视网膜血管的整体结构。到今天为止，我有一个文学缺乏详细描述胰蛋白酶消化技术n的鼠标。这份手稿提供了详细的一步一步的方法在小鼠视网膜中的胰蛋白酶消化，同时也提供了如何解决困难的步骤。
Introduction
可视化的视网膜血管解剖各种眼科疾病，如糖尿病性视网膜病变的机制，是一个非常重要的方法。它允许一个评估最早的血管异常，包括微血管瘤，毛细血管变性，和周细胞损失8,9。到今天为止，已经有几个技术分析视网膜血管。已用于各种染料灌注突出的船只，但是都共享了类似的限制。注射很少强调除非整个视网膜血管在高压下，破裂的风险和损坏的船只1。血管内皮细胞的免疫染色荧光标记ĝ凝集素B4（共轭的Alexa Fluor 594; I21413; Invitrogen公司; 1:100稀释）和视网膜平面坐骑可以突出整体建筑的船只，但没有详细的可视化毛细血管基底膜和周。有人指出由Friedenwald的船只可以突出碘酸-希夫（PAS）或苏木精伊红（H＆E）染色10平坐骑染色的视网膜。然而，染色呈非特异性的船只，以及突出的无血管组织，使其难以区分的船只。在20世纪60年代，科根和桑原开发的胰蛋白酶消化技术，使得它更容易显现视网膜血管消化的非血管成分的视网膜1。自那时以来，胰蛋白酶消化已成为金标法分析血管视网膜2-5。然而，重要的是要注意到，已经描述了其他替代技术的隔离的血管。渗透裂解的使用已被用于隔离的血管，并允许生化研究的组织11,12，但没有被使用作为一个主要的解剖学研究方法的程序。组织印刷方法一直用来隔离微血管和大段，允许学习能力的脉管13日电紧张的架构。从理论上讲，这种技术也可以用来研究解剖变化，作为船舶的质量是高的。但是，它是仅能够分离出整个血管网络段。虽然这些方法不能代替胰蛋白酶消化，重要的是要注意，它们具有不同的优点和缺点，在这方面是互补的。
胰蛋白酶消化法在技术上具有挑战性，并很难执行一致6,7。此外，人们已经注意到，胰蛋白酶消化的小鼠模型上是特别困难的，尤其是当一个人渴望保护视网膜6,7整体的血管结构。挑战包括：（1）在消化的视网膜，造成损失的脉管系统，以及无血管组织，（2）在消化，需要广泛的机械清扫继而可能导致损伤血管床，（3）分离度不佳导致非特异性染色血管的无血管组织。几个手稿都强调这些挑战，但都没有提供详细和一致的协议来克服他们14,15。这份手稿将引进一步一步的方法，详细介绍了具体处理特别困难的步骤提示进行胰蛋白酶消化小鼠和大鼠视网膜技术。 图1中所示的示意性概述。
Protocol
Representative Results
Discussion
胰蛋白酶的消化是一个标准的方法，以评估视网膜的血管。不幸的是，它在技术上具有挑战性，如果没有正确执行，并可能导致在标本亏损率很高。此外，在小鼠体内的过程是特别困难的，可以限制这一技术的应用在常用眼疾基因动物模型。本文提供了关于如何执行程序的有效和一致的小鼠眼睛的指导。
在协议中，有几个关键步骤。首先，它是至关重要的，视网膜仔细解剖?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
部分支持这项工作是由NIH RO1 EY019951（AAF），伊利诺伊州防盲协会（JCC，AAF），无限制的资金从研究到眼科部防盲（RPB），纽约和RPB医学学生团契格兰特（JCC）。
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
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