간엽 전환을 유도하고 상피의 분석
Summary
간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.
Abstract
중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 개발하는 동안 적절한 형태 형성에 필수적이다. 이 과정의 Misregulation 섬유증의 주요 이벤트 및 전이 상태로 암의 진행으로 연루되어있다. EMT 기초가되는 과정을 이해하는 것은 조기 진단과 이러한 질병 상태의 임상 제어를 위해 필수적입니다. 체외 EMT 신뢰성 유도 진단용 공통 유전자 발현 서명을 확인하는 유용한 약물 발견을위한 도구 등이다. 여기에서 우리는 세포 유형의 다양한 EMT의 유도에 대한 간단한 방법을 설명한다. 세포 면역 세포에 의해 사전 및 사후 EMT 유도의 분석을위한 방법도 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 항체 기반의 배열 분석 및 마이그레이션 / 침입 분석을 통해이 방법의 효과를 보여줍니다.
Introduction
중간 엽 전이 (EMT)에 상피는 편광 상피 세포는 높은 운동성, 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포의 결과로 다양한 변화를 겪게되는 과정이다. 이 프로세스는 마이그레이션 침공 증가 능력으로 인해, 유전자 발현 변화하고있는 adherens 접속점의 분해를 통해 부분적으로 발생한다. 생리 학적으로, EMT는 배아 발달과 상처 치유 동안 중요한 역할을한다. EMT에 적절한 제어의 손실 섬유증 및 암 1,2의 전이로 이어질 수 있습니다.
상피 세포의 표면 상에 E-카드 헤린의 감소는 EMT 3,4 통해 셀의 진행에 중요한 단계이다. E-카드 헤린 직접 인접 셀에 카데 단백질과 상호 작용하는 단일 통과 막 횡단 단백질이다. 세포 접착의 역할뿐만 아니라, E-cadherin의 영향을 세포 E-카데 린의 세포질 꼬리 사이의 상호 작용을 통해 신호규제 단백질의 다 다양한, 특히 β-catenin의. β-catenin의가있는 adherens 접속점의 안정화에 중요한 역할을한다. 정규 Wnt 신호 동안, β-catenin의는 E-cadherin의에서 해제하고이 Wnt 경로의 3,4,5의 하류 전사 인자 역할을하는 핵 옭. 핵에서 β-catenin이는 트위스트, 민달팽이, 피브로넥틴, 및 매트릭스 메탈로 3,6의 다양한 포함한 여러 EMT 관련 요인의 전사를 증가시킨다.
Wnts 이외에, TGF-β 시그널링은 정상적인 발달 과정 및 질병 상태 모두에서 7,8,9 EMT 유도에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. TGF-β는 구개 형성 과정과 개발 중심 (10)에서 발생하는 EMT에 참여하고있다. 또한 섬유증과 전이 7 암의 진행에 연루되어있다.
홍보는 여기에 설명 된 절차ovides 유전자 조작 없이도 세포 유형의 다양한 EMT의 일관된 유도. 이 절차는 E-cadherin의의 칵테일을 사용 sFRP-1 및 DKK-1 차단 항체로 Wnt-5a 및 TGF-β1 재조합 단백질. 이 칵테일은 Wnt의 및 TGF-β 신호를 강화하면서 E-cadherin의 기반 접착을 차단하도록 설계되어 있습니다. 강력한 EMT 유도하는 능력은이 과정의 생물학 방법과 치료 목적으로이를 조작하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. EMT의 보통주 현재 마커, E-cadherin의 (EMT에서 하향 조절) 및 (EMT 상향 조절) 멘틴은 암에서 공동으로 표현을 발견 할 수 있으며, 따라서 잠재적 전이성 셀 (12)의 최적의 진단 마커를 제공하지 않습니다. 중요한 것은, EMT를 겪은 세포 유형의 다양한 분석은 암 및 섬유증 11에서 진단 목적으로 이용 될 수있는 공통 유전자 발현 서명을 개발하는 것이 유용하다. 또한, 최근의 연구가 보여준 그 EMT는 EMT를받은 세포는 이러한 세포 13를 표적 수있는 화합물을 확인하는 약물 스크리닝에 유용 할 수 있다는 것을 시사 암 줄기 세포의 형성에 역할을 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMT 유도에 대한 이전의 방법은 일반적으로 TGF-β 자극 또는 유전자 조작을 사용했습니다. 단독으로 TGF-β는 일부 세포 유형에서 EMT를 유도하는 것으로 하였지만, 지금은 TGF-β가 EMT에 필요한 것을 설명 하였지만, 이는 모든 세포 유형 6,14에 충분하지 않다. EMT 유도를 위해 유전자 조작을 사용하면 시간과 노동 집약적이다. 여기서 설명한 방법은 항 – 인간 E-카드 헤린, 항 인간 sFRP-1, 항 인간 DKK-1, 재조합 인간로 Wnt-5A하여 확실 EMT를 유도하는 재조합 인간 TGF-β1 등 요인의 조합을 사용한다. 요소의 조합은 E-카드 헤린 계 접착 EMT 유도 사를위한 중요한 단계를 차단하도록 설계로 Wnt-5A 단백질을 추가 할뿐만 아니라 Wnt의 억제제로 차단하는 항체를 이용하여 Wnt의 시그널링을 보강하고, sFRP-1 DKK -1. 로 Wnt 및 TGF-β 신호가 중간 엽 세포의 합계를 유도하고 유지하기 위해 분비 루프에서 역할을하는 것으로 나타났다전자 6. 이 유도 방식은 유전자 조작을 방지하고 혼자 TGF-β를 사용하는 것보다 더 효과적입니다. 중요한 사실은, 우리는 이전에 (그림 5) 14 TGF-β 자극에만 반응하지 않는 것으로 나타났다 MCF7 및 PANC-1 세포를 포함한 세포 유형에 EMT의 유도를 관찰 할 수 있습니다.
EMT 유도하는 미디어 보충 쇼 이하 소형 증가 스핀들 모양의 형태 (그림 1)로 처리 된 세포. 또한 EMT (도 2 및도 3)의 특징입니다 피브로넥틴 발현의 증가와 함께 표면 E-cadherin의 동시 발현의 감소가있다. 이러한 멘틴과 달팽이 등의 추가 중간 엽 마커는 uninduced 컨트롤에 비해 EMT 유도 세포 (그림 4)에서 상향 조절된다. 향상된 이주 및 침윤 능력은 중간 엽 세포의 주요 기능적 특성이다. 체외에서 </em> 마이그레이션 및 침입 분석은 EMT 유도하는 미디어의 보충으로 처리 된 세포는 (그림 6)를 마이그레이션하고 침략 크게 증가 능력을 보여 주었다.
그림 7과 같이 항체 어레이 발현 데이터를 사용하여 설명 된대로 EMT 유도를위한이 간단한 방법은 EMT 신호의 연구에 유용합니다. 상이한 세포 유형은 인산화 된 CREB의 증가 및 MCF7 및 A549의 EMT-유도 된 세포 모두에서 볼 ERK1 / 2와 EMT와 연관된 일반적인 식 서명을 구하는 전후 EMT 유도를 비교할 수있다. CREB의 S133 인산화 바인딩 DNA를 자극하고 TGF-β1에 의한 EMT (15)의 하류 행동을 보였다. ERK1 / 2의 인산화는 TGF-β1에 의한 EMT (16)의 하류 행동을 보였다. p70S6 대 A549 세포에서 GSK-3β 인산화의 증가와 같이 세포 유형 사이에서 신호 전달 경로의 차이도 설명 될 수있다MCF7에서 K 인산화. 세린 9에서 GSK-3β 인산화는 기능을 감소하고, GSK-3β는 프로 EMT 전사 인자, 달팽이 17을 억제하기 위해 표시되었습니다. 반면, p70S6K 달팽이 활동을 유도하고 인산화는이 단백질 18의 활성화와 연결되어 있습니다.
전반적으로, 특히 이전에 단독으로 TGF-β에 응답하지 않는 같이 세포 EMT의 간단하고 신뢰할 수있는 유도, EMT의 생물학을 이해 예후 마커로 사용하기 위해 일반적인 표현의 서명을 확인하고, 암에 대한 새로운 치료제를 개발하고 평가하는 데 유용합니다 및 섬유 성 질병.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 도움이 토론과 원고 검토를 위해 줄리아 Hatler 마틴 Ramsden (R & D 시스템)을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
| Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
Referencias
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