Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas ^1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com ^1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas no fornecimento de tolerância no intestino ou do pulmão. Estes induzida Tregs potencialmente prevenir a ativação de células T após o reconhecimento de antígenos estranhos na mucosa, incluindo antígenos ambientais dos alimentos e do ar, bactérias comensais, e alérgenos ^3,4. Além disso, as Tregs são cruciais para estabelecer a tolerância aos péptidos materna e fetal ⁵ préventilação doença do enxerto-versus-hospedeiro ^6. Ao mesmo tempo, também Tregs mediar efeitos indesejados por meio da atenuação de vigilância imunitária de células tumorais ^7,8. O recurso marca de Tregs é a expressão do subconjunto-especificar o fator de transcrição Foxp3, um fator de transcrição contendo domínio fork-cabeça que é necessário e suficiente para conferir função Treg ^9,10. Algumas vias de sinalização que podem induzir a expressão de Foxp3 é conhecido. No entanto, os processos moleculares que controlam, regulam, modulam ou Treg diferenciação em resposta ao receptor de células T desencadeamento forem menos bem compreendidas.

Tregs pode muito eficazmente ser induzida in vitro através da estimulação das células T CD4 + naive com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 na presença de TGF-p e IL-2 ^11. Como o Tregs emergentes são funcionais in vivo, a manipulação de moléculas que promovem a diferenciação de Treg tem um enorme potencial para futuro therapies, por exemplo, o tratamento de asma, doença de Crohn, e transplante de ^11,12. Por outro lado, a modulação terapêutica de moléculas para bloquear a diferenciação Treg podem proporcionar benefícios em futuras abordagens de tratamento combinado dos pacientes com tumor.

Em ensaios de diferenciação in vitro têm sido fundamentais para a descrição de alterações moleculares que estão associados com a diferenciação subconjunto de células T. No momento, as tentativas experimentais para pesquisa ou na tela para produtos de genes que controlam a diferenciação de células T são dificultados pelo facto de que os métodos mais comuns de expressão do gene ectópico falhar em células T naive. Por exemplo, a transdução retroviral, electroporação e só são eficazes em células T activadas. Em contraste com as expectativas iniciais, transdução lentiviral, que é tipicamente eficaz em células em repouso, requer pre-activação de células T naive por citocinas ^13. Além disso, a transferência de cDNA ou mRNA durante electroporaçãoenvolve a despolarização da membrana plasmática, que se confere características de activação das células T e pode mesmo mobilização de ^{Ca2 +} sinalização e ativar proteínas NFAT (observação e ref inédito. ^14). Da mesma forma, para a transdução retroviral, as células T virgens tem que ser ativado para 18 – 40 hr. Durante este tempo, a ruptura da membrana nuclear durante a divisão celular ocorrer e permite a subsequente integração do genoma do vector retroviral ^15. Estes métodos não são, portanto, capazes de dirigir a regulação molecular inicial do encontro de células T inicial com o antigénio, que é a etapa determinante de diferenciação da célula T helper.

Transdução adenoviral é conhecido para conferir a expressão do gene ectópico transitória em um número de tipos de células humanas que expressam o receptor para o adenovírus humano de Coxsackie (CAR). Procede sem necessidade de activação celular ou na progressão do ciclo celular. A expressão de superfície de CRA é essencial para a ligação e internalização do vírus eficiente, e a expressão transgénica da versão truncada CARΔ1 sob um promotor específico de células-T foi encontrada para processar timócitos de ratinho e as células T sensíveis a infecção adenoviral ^16. Mais importante, o transgene não se alterar o desenvolvimento de timócitos ou a diferenciação in vitro de células T CD4 + naive em subconjuntos diferentes (dados não mostrados; Ref. ^17.). Adenovírus mediada transdução de células T foi usado anteriormente para superexpressão ^17,18 e knock-down abordagens ^19,20. As células T transgénicas podem ser purificados a partir comercialmente disponível DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref ^17.). Importante, a transdução adenoviral permite uma elevada expressão de um gene de interesse em células T virgens sem induzir sinais óbvios de activação. As células T permanecer ingênuo (CD44 ^baixo, CD62L ^high) e de repouso (CD25 ^-, CD69 ^-) após infectiem e podem ser activadas e diferenciadas em Treg semelhante a células não infectadas.

Produção de adenovírus recombinantes pode ser conseguida após a transfecção de células com plasmídeos HEK293A adenovirais (Figura 1). Estes plasmídeos contêm, tipicamente, o adenovírus tipo 5 do genoma humano com os genes E1 e E3 eliminados para processar os adenovírus recombinantes de replicação incompetente ^21. Células HEK293A complementar a deficiência de replicação como eles foram imortalizados através da integração estável de adenovírus cortado ^22. Como vectores adenovirais são grandes (~ 40 kb) e, consequentemente, não é adequado para a clonagem da enzima de restrição mediada tradicional, utilizou-se o sistema Gateway. O gene de interesse é, inicialmente, clonado num vector de entrada mais pequena, a partir da qual ele pode ser facilmente transferido para o vector adenoviral de destino por via da reacção de recombinação lambda (LR) ^23. Construímos o pCAGAdDu vectorcombinando o promotor CAG (promotor de actina de galinha e intensificador de CMV), com uma cassete de expressão contendo LR locais flanqueando o marcador procariota selecção ccdB ^24. Esta cassete de expressão está fundido com um local de entrada interno do ribossoma (IRES), elemento que permite a co-expressão do marcador de infecção melhorada proteína fluorescente verde eucariota (eGFP), que está fundido com uma sequência que contém a hormona de crescimento bovina poli (A) do sinal. Escolhemos as sequências de cis-reguladoras CAG, uma vez que o promotor de CMV prototípico foi encontrado para ser altamente dependente da activação e, portanto, desfavorável para a expressão de genes em células T naive.

Aqui, nós fornecemos um protocolo eficiente para a diferenciação Treg vitro e um método para a transdução de células T CD4 naive sem activação (Figura 2). O método permite a expressão gênica ectópica ou derrubar CD4 anteriores diferenciação de células T no estado ingênuo. Ele permite testar o efeito de uma overexpressed gene de interesse durante os eventos de sinalização início após a estimulação inicial até TCR compromisso subconjunto de células T. Nossos experimentos de validação também fornecem a base para estabelecer a aplicação adenovírus semelhante na diferenciação de outros subgrupos de células T, como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou células TFH.