גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.
זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח"י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.
תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת 1.
בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך 2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) 3 או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) 4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח"י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית 2 מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח"י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור.
כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח"י 5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח'. 7 להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח'. 5 טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה.
למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות 5,7-9) חקרו אח"י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל 1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול 10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח"י. דו"ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה.
טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי 19 הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה.
הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח"י.
שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי.</em…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי תחת הצמדת פרויקט מענק LP120100264.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture materials and equipment | |||
Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
Neurobasal media | |||
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
Intracellular solution | |||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Extracellular solution | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
Temperature controller | Warner | TC-324B | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
Table 3.Patch clamp equipment. | |||
1,870 nm laser diode | Optotech | ||
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
Table 4. Laser equipment. |