Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через<em> В утробе матери</em> Электропорацию
Summary
Несмотря на функциональные и медицинское значение гипоталамуса<em> Внутриутробно</em> Генетических манипуляций его развития редко пытались. Мы покажем, детальный порядок<em> Внутриутробно</em> Электропорации в гипоталамус мыши и шоу репрезентативные результаты полных и частичных (региональных) гипоталамуса трансфекции.
Abstract
Генетическая модификация конкретных регионах развивающегося мозга млекопитающих является очень мощным экспериментальным подходом. Однако, создавая мутантов романа мыши часто удручающе медленно. Было показано, что доступ к мозга мышей развивается внутриутробно с разумной пост-операторы выживание возможно. Тем не менее, результаты этой процедуры были зарегистрированы почти исключительно для самого поверхностного и легко доступной частью развивающегося мозга, то есть мозга. Таламус, более узком и медиальной области, оказалось более трудным для ориентации. Трансфекции в глубоком тех ядер, которые гипоталамуса, является, пожалуй, самым сложным и поэтому очень мало результатов не поступало. Здесь мы показываем, процедура ориентирована на весь гипоталамуса нейроэпителия или его часть (гипоталамус регионов) для трансфекции через электропорации. Ключи к нашему подходу длиннее наркоза раз, инъекции в тHird желудочка, и надлежащий вид и расположение электродов. Кроме того, мы покажем результаты адресности и последующим гистологическим анализом наиболее встраиваемые ядра гипоталамуса, тело сосцевидный.
Introduction
Генетические манипуляции с эмбриональными мозга мыши является предпочтительным подходом, чтобы узнать о развитии регулирования. Поколение мутантных линий мышей, однако, медленно и дорого. Один мощный метод введения специфических генетических изменений в развивающихся нейронов мозга млекопитающих является внутриутробно электропорации. По сути, методика состоит из трансфекции ДНК в эмбриональных нейроэпителия мозг посредством электрических импульсов, затем позволяя эмбриона выжить в течение определенного периода времени, собирают мозга и исследовать их возможного романа, информативным фенотипов. Таким образом, экспериментатор может проверить гипотезу почти сразу же, без длительных периодов ожидания необходимые для производства мутантных мышей.
Трансфекции ДНК в развивающихся эмбрионах началось с ово в электропорации на куриных эмбрионах 1. Существенным доказательством правильности концепции для мыши проводили в культуре <sдо> 2. Это было вскоре последовали первые описания техники на мыши внутриутробно 3,4.
Основная проблема заключается в трансфекции мозга эмбрионов развивается внутриутробно, не убивая их или матери. Изучение выполнить необходимые операции (лапаротомию, инъекцию, электропорацию) требует длительного периода подготовки. Как только операция была освоена до точки, где соотношение выживаемость эмбрионов является приемлемым, следующий ключевой вопрос: какие структуры мозга доступны? Не удивительно, что первые опубликованных работ показывает результаты, полученные с внутриутробно электропорации сосредоточены на развитии коркового 5-9. Это по-прежнему верно для большинства публикаций с помощью этой техники, так как область развивающегося мозга мыши наиболее доступной для хирургических процедур коры (рис. 1). Процедура внутриутробно электропорации в коре была описанав печати в 10 и 11-14 видео. Модификация методика может быть использована для нацеливания на вентральной частью конечного мозга, базальных ганглиев 15.
За конечный мозг, промежуточный мозг (классически разделен на таламус и гипоталамус) является областью переднего мозга труднее достичь. Небольшое число работ, отчетов адресности его спинной и наиболее доступной части таламуса 16-19.
Гипоталамус является самой вентральной части переднего мозга, поэтому один локализованный наиболее глубоко из дорсальной поверхности (кора) (рис. 1). Этот регион остается трудной задачей для исследователей стремится к генетически манипулировать мозга мышей в период внутриутробного развития. Насколько нам известно, лишь очень немногие статьи отчета об итогах внутриутробно трансфекции в гипоталамусе мышей 20,21. Однако функциональное значение гипоталамуса cannoт быть завышена, так как она регулирует поведение, как еда и питье, спаривание, селекции и воспитания 22. Кроме того, изменения в развитии гипоталамуса способствовать происходят позже в жизни условиях, таких как ожирение, гипертония, диабет и преждевременное половое созревание 23. Будучи в состоянии изменить генетически гипоталамуса во время развитию обеспечит очень мощный инструмент, чтобы понять это.
Основной хирургический протокол для лапаротомии беременных мышей, которые мы используем здесь аналогична использованной в других протоколов 11,13,14,24. Мы опишем здесь кратко рассказать для полноты картины. Ключом к нашему процедура, с другой стороны, являются тип анестезии месте инъекции, тип электродов и вставки и позиции положительного электрода по отношению к голове эмбриона. Мы предпочитаем, чтобы вызвать и поддерживать наркоз посредством вдыхания газа по сравнению с простыми анестезии внутрибрюшинной, поскольку оно включает в себяНесколько более длительных периодов наркоза при тяжелую операцию. Isoflurane результаты ингаляции в быстрое восстановление после анестезии, так как обычно мать демонстрирует нормальное поведение уже минут после операции. Самый простой точке ввода этого раствора ДНК со стеклянной микропипетки в боковой желудочек, который, однако, совершенно непригодны для гипоталамус электропорации. Инъекций непосредственно в третий желудочек действительно важно, чтобы целевой глубоко диэнцефальных структур. Вполне возможно, для трансфекции гипоталамус от E12.0 E12.5 или со стандартными, имеющийся в наличии электроды. Мы обнаружили некоторые из электродов производства Nepa гена (Chiba, Япония), особенно хорошо подходят для этой цели.
С нашим образом получаем трансфекции всего гипоталамуса нейроэпителия или частичное, региональных трансфекции в зависимости от ориентации электрода. Здесь мы показываем, метод, с помощью трансфекции тела сосцевидный, возможно,Самая глубокая и встраиваемые всех ядрах гипоталамуса. Кроме того, мы покажем подробный гистологический анализ трансфекции клеток вплоть до клеточного уровня разрешения.
Сравнение внутриутробно электропорации с другими подходами к трансфекции мыши развивающегося мозга внутриутробно, можно найти в разделе обсуждения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Об анестезии: С внутриутробно электропорации в гипоталамусе может быть технически трудной и требует большего времени наркоза, мы предпочитаем, чтобы вызвать и поддержания анестезии при введении смеси кислорода и изофлурана. По нашему опыту, животные могут оставаться соответству…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Немецкого исследовательского фонда (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
Referencias
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociencias. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neurociencias. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
