יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית
Summary
מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.
Abstract
תאי הגנגליון הם תאי עצב הפלט של הרשתית ופעילותם משקפת את האינטגרציה של קלטים סינפטיים מרובים הנובעים ממעגלים עצביים ספציפיים. טכניקות תיקון מהדק, מהדק מתח ובתצורות מהדק הנוכחי, משמשות בדרך כלל כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של תאי עצב ולאפיין התשומות סינפטיים שלהם. למרות היישום של טכניקות אלה הוא אינפורמטיבי מאוד, הם מציבים מגבלות שונות. לדוגמה, קשה לכמת את האופן שבו האינטראקציות המדויקות של תשומות מעוררות ומעכבות לקבוע פלט תגובה. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בטכניקה שונה נוכחית מהדק, מהדק דינמי, המכונית גם מוליכות 1 מהדק, 2, 3 ובדקנו את ההשפעה של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות על רגישות עצבית. טכניקה זו דורשת הזרקה של זרם לתוך התא ותלוי במשוב בזמן אמת של פוטנציאל הקרום שלה באותו זמן. Injecteד הנוכחי מחושב מראש conductances מעוררים והמעכב, הפוטנציאלים סינפטיים היפוכם ואת הפוטנציאל המיידי הקרום של התא. פירוט השיטה הניסיוני, תיקון הידוק תאים כדי להשיג תצורה כל תא ותעסוקה של טכניקת המהדק הדינמית באות לידי ביטוי במאמר זה וידאו. כאן, אנו מציגים את התגובות של תאי הגנגליון ברשתית עכבר לצורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחותו של סמים. יתר על כן, אנו מציגים את השימוש בconductances מעוררים והמעכב המלאכותיים שנוצר באמצעות פונקציות אלפא לחקור את התגובות של התאים.
Introduction
הרשתית היא רקמה עצבית כמעט שקופה המצפה את החלק האחורי של העין. מחקרים רבים משתמשים ברשתית כמודל כדי לחקור את צעדיו הראשונים בעיבוד חזותי ומנגנונים של איתות הסינפטי. מאז רשת הרשתית בהכנה כל ההר נשארה שלמה לאחר נתיחה, הוא מייצג מערכת אידיאלית ללמוד אינטראקציות הסינפטי כתגובות הפיזיולוגיות שלו דומות מאוד לתנאים בvivo. כך, באמצעות רשתית מבודדת את המאפיינים של תאי העצב שלו ניתן ללמוד תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון (לביקורות על הטכניקה, ראה 6,9,13). זיהוי התרומה של מעגלים ומוליכים עצביים לתגובת תא גנגליון הספציפיים המדויקת, לעומת זאת, בדרך כלל הפריע כסוכנים תרופתיים לפעול באתרים שונים.
תגובות פיסיולוגיות של תאי עצב ברשתית לאור, הגירוי הטבעי, ניתן להקליט עם pipettes זכוכית מלא בנוזל תוך תאי. באמצעות תיקון CLטכניקות מגבר, תגובות עצביות לגירוי אור ניתן להקליט כמו תנודות פוטנציאל הממברנה (מהדק נוכחי) או כזרמים (מהדק מתח). על ידי החזקת פוטנציאל הממברנה במתחים שונים וביישום ניתוח מוליכות בדיעבד, אפשר לבודד את תשומות סינפטיים מעכבות ומעוררות 5,12. סוג זה של ניסויים יכול להתבצע במדיום רחצה רגיל ובנוכחותם של סוכנים תרופתיים שונים כדי לבודד את תרומתו של נוירוטרנסמיטורים ואת הקולטנים לתגובות עצביות שונים. שפע של מחקרים ממעבדות רבות אפיין את התלות של תפוקה ותשומות spiking מעוררות ומעכבות על נכסי תמריצים כגון גודל, בניגוד, תדרי מרחב ובזמן, כיוון, כוונה ומשתנים גירוי אחר. אם כי אלה גישות ניסיוניות לספק מידע על הקשר בין התפוקה ותשומות ספייק סינפטיים כפונקציה של מאפייני גירוי,הפרשנות של התרומה של סוגי תאים מסוימים והתשומות סינפטיים לרגישות תא היא לא פשוטה. זאת בשל העובדה שהן בדרך כלל תשומות מעוררות ומעכבות להשתנות עם מאפייני גירוי ולכן, לא ניתן להעריך את ההשפעה המדויקת ששינויים בכל אחד מתשומות אלה יש בspiking העצבי.
גישה חלופית כדי לעקוף מגבלות אלו היא לבצע הקלטות מהדק דינמיות, המאפשרות הערכה ביקורתית של התרומה של תשומות סינפטיים בודדות לspiking פלט. טכניקת המהדק הדינמית מאפשרת הזרקה ישירה של זרם לתוך התא ואת כמות המוזרקת נוכחי בזמן נתון תלויה בפוטנציאל הקרום נרשם באותה תקופה 1,2,3 (לסקירה, ראה 7,14). זוהי הגדרת מהדק נוכחי שונה שבו אינטראקציה משוב בזמן אמת, במהירות בין התא מתחת להקלטה והציוד הכולל חומרה מיוחדת, התוכנהומחשב מושגת. כמות המוזרקת הנוכחי לתוך התא מחושבת בהתאם. לפיכך, היתרון של שיטה זו הוא שהתא יכול להיות מגורה עם שילובים של צורות גל מוליכות שונות, והתגובה שלה תהיה לחקות את ההפעלה של קולטנים שמתווכים תשומות סינפטיים. לדוגמה, השוואה בין התגובה להזרקה של conductances המעוררות והמעכב לנקודה קטנה עם התגובה להזרקה של מוליכות הגירוי לנקודה קטנה מספקת מידע לגבי ההשפעה של עיכוב בתגובת תא בלבד. כמו כן, שילובים אחרים של conductances נרשם פיסיולוגיים יכולים להיות שותף הזריק לחשוף כיצד גירוי תלוי שינויים בconductances המעוררות ו / או מעכבות משפיעים על התפוקה בספייק.
במחקר שלנו, נעשתה שימוש בטכניקת המהדק הדינמית כדי להדגים את ההשפעה של המשרעת והעיתוי של תשומות סינפטיים על מאפייני הירי של תאי הגנגליון ברשתית היחסי. conductances השוניםהמתקבל מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחות של סוכנים תרופתיים הועסקו כתשומות. בנוסף, conductances מלאכותי המבוסס על פונקציות אלפא שמשו גם כדי לחקור כיצד תשומות סינפטיים משולבות על ידי תאי עצב. לכן זו היא טכניקה צדדי המאפשרת סוגים שונים של מוליכות נוצרו גם מבחינה פיזיולוגית, פרמקולוגית או המחשוב להיות מוזרקים לתוך אותו תא גנגליון, ולכן השוואה של תגובות לתשומות אלה יכול להתבצע.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים את השימוש במהדק דינמי כדי להעריך את ההשפעה של היחס והתזמון יחסי של עירור ועיכוב בתפוקת תא הגנגליון ברשתית. מהדק דינמי עושה שימוש בסימולציות מחשב כדי להציג את conductances סינפטיים פיזיולוגית מוקלט או מלאכותי לנוירונים חיים. מתודולוגיה זו מספקת כלי אינטראקט…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר האוסטרלית (ARC DP0988227) וחקר המדעים ביו גרנט היוזמה מהדיסציפלינה של המדע ביו, אוניברסיטת סידני. מגבר הצמד תיקון ציוד EPC 8 מומן על ידי קרן האתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. מערכת ציוד InstruTECH LIH 8 8 נתונים הרכישה נרכשה בכספים מרבקה ל 'קופר קרן וקרן אתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. ברצוננו להודות לסוקרים אנונימיים לקבלת ההצעות והערות תובנה שלהם.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
Referencias
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
