Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos
Summary
Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.
Abstract
Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.
Introduction
Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidrólisis de la celulosa a glucosa 1,2, que proporciona un sustrato de carbono utilizable para la absorción y asimilación microbiana. La enzima fosfatasa libera grupos fosfatos inorgánicos solubles de organofosfatos, esencialmente mineralizantes fosfato y su puesta a disposición para su uso por la mayoría de los organismos 3. Otras enzimas, tales como N-acetilglucosaminidasa (la NAGase), son IMPORTANTESt en la degradación de la quitina y puede hacer tanto el carbono y el nitrógeno disponible para la adquisición microbiana 4.
Uno de los procedimientos para el ensayo de actividad de la enzima microbiana extracelular en ambientes naturales es el uso de p-nitrofenil artificial de sustratos enlazados (p NP), un enfoque que se desarrolló originalmente para detectar la actividad fosfatasa de suelo 5. Este enfoque se basa en la detección de un producto final coloreado, p-nitrofenol, que se libera cuando el sustrato artificial es hidrolizado por la enzima apropiada. El p-nitrofenol puede posteriormente cuantificar colorimétricamente midiendo su absorbancia a alrededor de 400-410 nm. Este método ya se ha aplicado para detectar otras enzimas tales como la NAGase 6, y se ha utilizado en varios estudios en busca de actividad de la enzima microbiana extracelular en los suelos y sedimentos 7-9.
Un enfoque alternativo que era originally desarrollado para evaluar la actividad glucosidasa extracelular en ambientes acuáticos 10,11 hace uso de (MUB) sustratos ligados 4 metilumbeliferona. El producto final liberado (4-metilumbeliferona) es altamente fluorescente y puede detectarse utilizando un fluorómetro con un ajuste de excitación / emisión de alrededor de 360/460 nm. Una variedad de sustratos artificiales MUB enlaces-están disponibles, permitiendo la medición fluorométrica de la actividad de al menos el mayor número de enzimas (por ejemplo, β-glucosidasa, celobiohidrolasa, Nagase, fosfatasa) como puede ensayarse usando el procedimiento colorimétrico-NP sustrato p. Otras enzimas extracelulares microbianos, tales como la aminopeptidasa de leucina en proteínas degradantes, se pueden ensayar fluorométricamente utilizando 7-amino-4-metil-cumarina (COU) sustratos enlazados. Tanto MUB-y sustratos COU vinculados se han utilizado para determinar la actividad de la enzima en varias muestras terrestres y acuáticos 12,13.
Mientras que los estudios anteriores han described microplaca fluorométrico o colorimétrico se acerca para determinar la actividad enzimática extracelular 14, hay una necesidad de una presentación clara de cómo llevar a cabo dichos ensayos. Aquí se demuestra los procedimientos para la realización de técnicas de alto rendimiento de la microplaca para el análisis de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos, utilizando el enfoque sustratos NP-linked p colorimétrico y en aguas naturales mediante la técnica fluorescente sustratos MUB enlazada. Nos centramos en la medición de las actividades de β-glucosidasa, la NAGase, y fosfatasa como estas enzimas pueden estar vinculados a carbono, de nitrógeno, de fósforo y el ciclismo, respectivamente. Sin embargo, los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar a la medición de otros enzimas extracelulares utilizando diferentes sustratos artificiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica 17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de los aspectos de este trabajo fue proporcionada por diversas fuentes, incluyendo el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Acuerdo de Cooperación Específico 58-6408-1-595 y la Fundación Nacional de Ciencia (premio 1.049.911).
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referencias
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