Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em> In Situ</em> A hibridação em<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Figuras 1 e 2 são esquemas dos procedimentos experimentais peixes e dutos de análise de imagem utilizado para quantificar as imagens dos peixes. 1. Soluções para preparar * As soluções abaixo são para uso com sondas cantor. Se estiver usando sondas Stellaris, substituir "40% formamida" com "10% de formamida" tanto Tampão de Hibridização e tampão de lavagem. Alterações adicionais Tampão de Hibridização quando utilizando sondas Stellaris são: (1) adicionar 1 g de sulfato de dextrano e (2) não incluem 10 mg ssDNA. Tampão B 8 ml de 1 M de KH 2 PO 4 41,5 ml de 1 M de K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Tampão Spheroplasting 890 mL de buffer B VRC 100 mL 10 ul de 25.000 U / ml de liticase 2 ul β-mercaptoetanol <strong> tampão de hibridação (10 ml de volume final) 10 mg de E. coli tRNA 10 mg de ssDNA * 100 l mM estoque 200 VRC 40 ul de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 10 ml de volume final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampão de hibridização pode ser mantido em alíquotas de 0,5 ml a -20 ° C por conveniência. Tampão de Lavagem (50 ml de volume final) 5 ml de 20X SSC 20 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 50 ml de volume final) Rotulagem de buffer 1,06 g de carbonato de sódio 100 ml de água DEPC pH 9 2. Sonda-rotulagem (Sondas Cantor Only) Nós obtemos estas sondas por síntese em casa usando um aparelho síntese de oligonucleotídeos ABI. Distróficoaliado, 4-5 ~ 50 pb são sintetizados oligonucleótidos que são homólogos ao gene de interesse, substituindo-alil-amino-timidina por vários thymidines espaçadas de pelo menos 8, de preferência de + 10 pb separadas. Por causa de sua sensibilidade ao ozônio, nós trabalhamos em uma instalação livre de ozono ao usar tinturas CY. Obter ~ 5 sondas e ressuspender em 100 mL de água – as concentrações de seleção na Nanodrop. Dependendo de quantas sondas / gene, combine total de 10 mg / oligonucleotídeos gene (por exemplo, se tiverem 5 sondas / gene, então quero 2 mg / sonda). Use colunas QIAquick para purificar as sondas de acordo com o Kit QIAquick Nucleotide remoção protocolo. Adicionar 10 volumes de tampão PN ao volume total de sondas combinadas e misture. Aplicar a amostra para a coluna QIAquick – se o volume total é superior a 750 mL, spin para baixo duas vezes com metade do volume em cada rodada Deixe repousar por 1 min. Centrifugar 1 min a 6000 rpm. Lavar com 750 mL de tampão PE. Centrifugador1 min a 6000 rpm. Elimine o fluxo através da coluna e re-centrifugação durante 1 min a 13.000 rpm a secar. Coluna QIAquick lugar no novo tubo de microcentrífuga e DNA eluir com 50 mL H 2 O – Certifique-se de H 2 O pH está dentro de 7.0 e 8.5 e é colocado diretamente na membrana. Deixe repousar por 1 min. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 rpm, para eluir o DNA. Liofiliza-se o ADN a 45 ° C. Ressuspender o sedimento em 10 ul de tampão de marcação e adicionar ao tubo do corante sem tocar no corante. Repita com outro buffer rotulagem 10 ml. Vortex e spin para baixo tubo de tinta e DNA. Cubra os tubos com papel alumínio e manter no escuro, a RT O / N para rotular. Repita QIAquick Nucleotide Removal Kit protocolo. Execute com duas diferenças: – Adicionar 200 mL de tampão PN sondas e colocar sondas marcadas através de colunas de 2x. – Realizar três lavagens com tampão PE, a fim de lavar qualquer corante solto antes de eluição. After eluição obter concentração via NanoDrop. A eficiência de marcação é tipicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de cadeia simples. 3. Lamela Preparação Coloque lamelas em slides em Plasma-preen câmara de vácuo ( http://www.plasmapreen.com/ ) (o mais próximo do centro, melhor). Coloque câmara de vácuo no microondas e verifique se ele está selado. Ligue a bomba primeiro e depois ligar a bomba de vácuo apenas uma vez é iniciado. Ligue o forno de microondas, e parar de 5 segundos após plasma é visível. Desligue o vácuo depois da bomba. Retire a câmara de vácuo e remover lamelas com uma pinça (aqueles que caíram precisam ser limpos novamente). Lugar Lamelas lado limpo em placas de 12 poços. 4. Procedimento de fixação Levedura crescer a uma DO600 de cerca de 0,1-0,2 em meio mínimo. 10 ml de células produz suficiente for ~ 10 hibridações separadas. Adicione 1/10 volume 37% de formaldeído diretamente para a mídia de crescimento (10 ml de cultura + 1 ml de 37% de formaldeído) e deixe descansar por 45 min. Lavar 2x com 1 ml de tampão B gelado num tubo de microcentrífuga (pode girar a 13.000 rpm durante 1 min.) Adicionar 1 ml de tampão spheroplasting. Incubar a 37 ° C durante 15 min. Confira as células a cada poucos minutos, sob microscópio até a maioria das células são negros (ou seja, não phase-brilhante). Lavar 2x com tampão B gelado, girando a uma velocidade baixa (~ 3500 rpm). Adicione 1 ml de EtOH a 70%, ressuspender cuidadosamente e deixar durante a noite a 4 ° C (pode armazenar indefinidamente a -20 ° C). 5. Procedimento de Hibridação Preparar a solução de hibridização: para 100 ul de tampão de hibridação, adicionar 1-3 mL de detecção, depois vórtice e centrifuga-se. Sondas Cantor usar 8-10 total de ng por conjunto da sonda (ou seja, por gene). Temos fotografada até três genes simultaneamente com três difsonda marcada rente define. Certifique-se de aquecer a solução de hibridização à temperatura ambiente antes de abri-lo. Para sondas Stellaris, recomenda-se iniciar quatro reacções de hibridação em separado pela adição de 1 ul de cada uma de 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluições de trabalho de sondas para ver qual é óptima. Diluições de trabalho de sondas Stellaris são preparadas em tampão de hibridação. Centrífuga (para todos os passos subsequentes, 3.500 rpm, 5 min) as células fixas (por exemplo, 200 ul) e aspirar para fora do etanol. Suavemente ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem que contém a mesma percentagem de formamida como tampão de hibridização. Deixe repousar por 2-5 min. Centrifugar amostra e tampão de lavagem aspirado, em seguida, adicionar solução de hibridização. Incubar no escuro, com agitação suave, O / N a 37 ° C. Nota: o procedimento a seguir é para a aplicação de células / Imagem em lamelas. Para wcalcinação / células de imagens em placas de 96 poços, incluindo limpador solução alternativa espécies reativas de oxigênio ver http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols. No dia seguinte, ou antes, limpo (ver procedimento) e tratar lamelas com 150 ul de 0,01% de poli-L-lisina, durante 5 min. Aspirar, deixe secar, lave 3x com dH 2 O e deixe secar. Na manhã seguinte, adicionar 1 ml de tampão de lavagem para a amostra, ressuspender cuidadosamente, de centrifugação e aspiração, ressuspender em seguida mais 1 ml de tampão de lavagem e incubar a 37 ° C durante 30 min. Lava-se com 2X SSC + 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente no agitador de 15 min. Tome meio de montagem de freezer para permitir que ele venha até RT antes da montagem. Lava-se com 1X SSC a RT 15 min, em agitador. Diluir DAPI em PBS (0,1 ug / ml final) e ressuspender as células em 150 ul. Solução local para limpeza / poli-Lys-tesouroted tampa desliza na placa de 12 poços, de pelo menos 30 minutos sem ser perturbado. Remova a solução (você pode colocá-lo em uma lamínula de reposição como um backup) e lavar 3x com 1 ml de 1X PBS. Coloque 3 ml de prolongar meio de montagem de ouro em um slide (Invitrogen P36934). Faça isso um de cada vez se você tiver vários deslizamentos de cobertura para evitar a secagem do meio de montagem. Adicionar ~ 0,5 ml de etanol a lamela na placa de 12 poços, remover a lâmina de cobertura e de ar seco, mantendo, com uma pinça. Coloque a tampa do lado da cela de deslizamento para baixo em meio de montagem e deixar endurecer várias horas ou O / N no escuro. Selar as bordas com unha polonês e proceder à imagem. 6. Imagem de células com Olympus IX-81 Visão geral microscópio invertido Para a aquisição de imagens que utilizam software Slidebook (inteligente-imaging.com) e 100X, 1,45 NA, objetivo petróleo TIRFM. Para a série GFP, DAPI, Cy3, Cy5 Cy3.5 e imagem: conjuntos de filtros Chroma (ver reagentes). Use filtro DAPIpara encontrar e concentrar células. Definir isso como ponto de referência. Tome uma z-stack de imagens ao redor do ponto de referência onde a distância total é de 5 mm com tamanho de 0,2 mM (25 aviões). Repita para cada canal de corante (ou seja, conjunto de cada sonda). Exportar como um TIFF de 16 bits para análise de imagem. 7. Resumo Análise de Imagem (Sondas cantor) Abaixo fornecemos um esboço de métodos computacionais que usamos para a análise de imagens de peixes em MATLAB. As funções do MATLAB relevantes utilizados estão entre colchetes à direita. Os algoritmos e limites estão ajustados para dados de sondas estilo cantor. Usando sondas estilo Stellaris exigirá algum ajustamento, particularmente para o passo final de filtragem (7.8). Identificação de células 15 Celas separadas de fundo usando um limiar global sobre DAPI imagens de 16 [graythresh]. Identificar núcleos usando a função maxima estendida [imextendedmax]. Células segmento usando núcleos como sementes para um algoritmo de watershed [divisor de águas]. Encontrar pontos em cada canal de fluorescência Executar a transformação cartola para normalizar fundo e melhorar a relação sinal-ruído [bwmorph]. Encontrar máximos para identificar a camada de focagem (no plano z) para cada mancha [imregionalmax]. Filtrar pontos potenciais usando um modelo de ajuste linear a um gradiente radial. Intensidade da mancha medida e sinais de filtro simples vs múltipla sonda Montar um perfil gaussiano 2D para o local na camada de focagem previamente identificados e intensidade de estimativa 17. Filtrar os pontos fracos que utilizam um limiar (baseado em um histograma). Para o tipo de cantor sondas isso é importante, mas é menos para as sondas Stellaris. Contagem de pontos em cada célula.