التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em> في الموضع</em> التهجين في<em> خميرة الخباز</em
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء التجارب لأداء الإسفار<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) لحساب mRNAs وفي الخلايا واحد في قرار جزيء واحد.
Abstract
مضان التهجين في الموضع (FISH) أسلوب يسمح احد للكشف عن الأحماض النووية في البيئة الخلوية المحلية. ونحن هنا نقدم بروتوكول لاستخدام الأسماك لتحديد عدد خلايا الخميرة في mRNAs واحد. يمكن زراعتها الخلايا في أي حالة من الفائدة ومن ثم إصلاح وجعل نفاذية. وفي وقت لاحق، وتستخدم متعددة deoxyoligonucleotides الذين تقطعت بهم السبل واحد مترافق إلى الأصباغ الفلورية لتسمية وتصور mRNAs و. وكميا مضان الحيود محدودة من جزيئات الرنا واحد باستخدام خوارزمية بقعة الكشف لتحديد وحساب عدد mRNAs ولكل خلية. في حين أن أساليب القياس الكمي أكثر القياسية من البقع الشمالية، RT-PCR وميكروأرس التعبير الجيني تقديم معلومات عن متوسط mRNAs والسكان في الجزء الأكبر، FISH يسهل كل من العد وتوطين هذه mRNAs وفي الخلايا واحد في قرار جزيء واحد.
Introduction
باستخدام تقنيات قياس السائبة، وأنه ليس من الممكن لفحص عدد من النصوص أو النشاط النسخي داخل الخلايا واحد 1. ويمكن استخدام البروتينات الفلورية يقودها المروجين من الفائدة للصحفيين في التعبير الجيني معالجة هذه المسألة إلى حد ما، ولكن الوقت اللازم لالبروتينات الفلورية إلى أضعاف يحجب ديناميكية في وقت مبكر. البروتينات الفلورية طويلة الأجل أيضا لا يمكن أن يقدم تقريرا أعمار مرنا. طريقة FISH يمكن استخدامها لفحص مرنا خلال دورة الحياة الكاملة، من بدء النسخ في النواة إلى النضج اللاحقة والاضمحلال في الخلايا واحدة، مع قرار جزيء واحد.
النص الأصلي التجارب في الموقع لتصور الأحماض النووية المستخدمة تحقيقات RNA رديولبلد لبحث عناصر الحمض النووي. وشملت هذه تصور الحمض النووي الريباسي في المبيضين من الضفدع القيطم المورق 2 والحمض النووي القمر الصناعي في الأنسجة الماوس 3. أول الفلورسنت خبرة في الموقعتستخدم iment جزيء RNA ملحوظ مع fluorophore للتحقيق خاصة تسلسل الحمض النووي 4. وكان أول تطبيق لتحقيقات الفلورسنت لتصور الحمض النووي الريبي في الموقع التصور من الأكتين التعبير الجيني في عضلة الدجاج زراعة الأنسجة 5. وفي الآونة الأخيرة، في الخميرة في مهدها، وقد استخدمت FISH للتحقيق التذبذبات في النسخ خلال دورة التمثيل الغذائي الخميرة 6، واضمحلال mRNAs وخلال دورة الخلية تطور 7، وتوطين المكانية من النصوص مرنا أثناء الانقسام 8. وقد استخدمت الأسماك في الخميرة لإظهار أن تقلبات غير مترابطة في الجينات المحولة بشكل جوهري، التي تشكل أكثر من نصف جميع جينات الخميرة، تنشأ من غير مترابطة بدء النسخ 9. في الأنواع غير الخميرة، وقد استخدمت FISH لتحديد علامات الخلايا الجذعية في الأمعاء الماوس 10 و لتحديد أن انتفاذ غير مكتملة من مصائر خلية يمكن أن تنجم عن التقلبات العشوائية التعبير الجيني في C.الأجنة ايليجانس 11.
طريقة FISH الموصوفة هنا يعمل عن طريق التهجين صبغ المسمى، تحقيقات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد لمرنا الرسائل. يتم تصوير الخلايا ويتم حساب mRNAs وباستخدام خوارزمية للكشف عن بقعة. يمكن أن تتولد تحقيقات واحد الذين تقطعت بهم السبل مع المزج الحمض النووي ومن ثم المسمى (المشار إليها هنا كما تحقيقات المغني) أو أمر تجاريا باسم تحقيقات ما قبل المسمى (تحقيقات ستيلاريس) 12،13. وهناك فرق كبير بين المغني وستيلاريس تحقيقات هو أن تحقيقات المغني هي أطول (~ 50 BP) ومتعددة وصفت في حين أن تحقيقات ستيلاريس قصيرة (~ 20 BP) مع تسمية واحدة فقط لكل التحقيق، كما وصفها راج وآخرون 14. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم نهج ستيلاريس العديد من تحقيقات في الجين من ذلك من المغني (~ 30 مقابل 5 تحقيقات في الجينات، على التوالي). أدناه ونحن نقدم البروتوكول الذي يصف استخدام أي نوع من التحقيق. في القسم 2، ونحن نقدم بروتوكول لوصفها الأميني الآليل تحقيقات التي تحتوي على ثيميدين-Wإيث صبغة قبرصي الذي تم اختياره. وتقدم لمحة عامة عن الخطوات الحسابية المطلوبة لتحديد اماكن مرنا واحد في القسم 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن، وقد تم FISH في المقام الأول وسيلة الإنتاجية المنخفضة. استخدام CY3، Cy3.5، والأصباغ Cy5 يحد من عدد من الجينات يمكن لأحد أن التحقيق في الخلايا واحد إلى ثلاثة في وقت واحد. وقد وضعت بعض تحقيقات إضافية (ستيلاريس) ولكن عدد من تحقيقات تمييزها لا يزال سبعة كحد أقصى. للتحايل على هذا القيد، وقد استخدمت استراتيجيات التوسيم اندماجي باستخدام fluorophores متعددة لخلق الباركود لأنواع مختلفة مرنا 19،20. وفي الآونة الأخيرة، وتستخدم لوبيك وتساى المتوازية الضوئية والطيفية لتحديد 32 نوعا مختلفة في وقت واحد مع السمك في خلايا الخميرة واحد 19. واحد الحد من هذا النهج اندماجي الأخيرة هو أنه يتطلب استخدام فائقة قرار المجهري. التحليل اللازمة لتمييز تحقيقات barcoded هو أيضا معقدة جدا.
لقد وجدنا أن CY3 وCy3.5 هي الأفضل لCy5 للتجارب FISH. واحدة من القيود المفروضة على صبغ Cy5 هو حساسيتهالphotobleaching. ومع ذلك، وضعت مؤخرا ستيلاريس Cy5 المتغيرات التي يتم الإعلان عنها على أنها أكثر مقاومة للphotobleaching، وربما تخفيف من حدة هذه مسألة تقنية. ومن الجدير بالذكر أيضا أن الأسماك هي طريقة مكلفة لتنفيذ وأن كلا من المغنية وستيلاريس تحقيقات تكلف عادة 700 $ – 1،000 $ لكل مجموعة التحقيق، رغم أن الأسعار لتحقيقات المتاحة تجاريا يجب أن تنخفض في المستقبل. تجنيب من الكواشف ووضع العلامات كفاءة يجلب تحقيقات المغني وصولا الى أقل تتراوح في السعر.
واحدة من التحديات التقنية الكبرى هو فصل اماكن مسبار واحد مقابل متعددة، الأمر الذي يتطلب تنفيذ خوارزميات بقعة تحديد متطورة. هذا يمكن أن يستغرق المراجعة اليدوية واسعة لضبط المعلمات تحليل الصور عن الاجهزة التجريبية المحددة. وتقدم الخطوط العريضة من خط أنابيب الحسابية لدينا مع وظائف MATLAB ذات الصلة في المادة 7 من البروتوكول. يتم إنزال بعض الشيء هذه المشكلة عن طريق تحقيقات ستيلاريس التي لديها فقط تسمية واحدة في التحقيق. وبالتالي فإنه يتطلب colocalization من تحقيقات متعددة في رؤية إشارة.
لأن FISH يتطلب تحديد الخلايا، فإنه لا يسهل تتبع الخلايا الفردية مع مرور الوقت. سابقا، كنا البيانات لقطة FISH لإعادة بناء ديناميات التعبير الجيني في عملية الأيض الفردية السكان الخميرة الدراجات 6. ويلاحظ الدراجات التمثيل الغذائي في مرحلة ما قبل المتعطشة، الثقافات المستمر، ويتميز التذبذبات الجماعية على نطاق السكان في استهلاك الأكسجين. وترتبط هذه التذبذبات مع التذبذبات على نطاق الجينوم من النصوص التي تحدث عن نصف جميع جينات الخميرة في مراحل مختلفة من استهلاك الأوكسجين. سعينا لتحديد ما إذا كان ركوب الدراجات الأيض موجودة في الثقافات غير المتزامنة الخميرة المستمر. إذا كان موجودا، وينبغي أن النصوص التي هي المضادة للارتباط في السكان متزامن أيضا أن تكون مضادة للالمترابطة في الخلايا واحد متزامن، والعكس بالعكس من النصوص المترابطة.
الأنف والحنجرة "> لإعادة بناء ديناميات الإنتاج مرنا في الوقت المناسب، ويجب مقارنة البيانات المرصودة لقطة ما هو متوقع من نموذج للسلوك الكامنة. هناك قيود النظرية إلى حين مثل" لقطات "من بيانات التعبير الجيني يمكن أن تستخدم لتحديد الكامنة وراء ديناميات التعبير الجيني والذي أنواع النماذج ويمكن تمييز 21. للبيانات دورة الأيض، بدلا من أن تظهر مباشرة وجود التذبذبات الزمانية، تم تنفيذ القياسات الإحصائية لإثبات أن هناك فعلا خلية برنامج متذبذبة مستقلة بما يتفق مع ميكروأري السائبة القياسات.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة GM046406 (لDB) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة مركز لعلم الأحياء الكمي (GM071508). RSM يقر تمويل من جبهة الخلاص الوطني عليا بحوث زمالة. معتمد من قبل MNM زمالة لويس سيغلر. ونود أن نعترف أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة كبير قادتها وأعضاء سابقين أليجرا بيتي ونيكولاي Slavov لمساهماتها في المشروع دورة التمثيل الغذائي. نشكر دانيال Zenklusen وروبرت سينجر عن الوصول بنا بدأت مع طريقة FISH.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
| Lyticase | Sigma | L5263 | |
| E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
| BSA (RNase free) | Ambion | ||
| Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
| DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
| PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
| Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
| Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
| Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
| Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
| 1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
| 100% Ethanol | |||
| Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
| Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
| Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
| Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
| Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
| FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
| Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
| 12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
| Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
| EQUIPMENT | |||
| Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
| Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
| Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
| 100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
| Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
| Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
| Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |
Referencias
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).
- Jones, K. W. Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells. Nature. 225, 912 (1970).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).
- Silverman, S. J., et al. Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).
- Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast. Cell. 147, 1484-1497 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).
- Itzkovitz, S., et al. Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine. Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).
- Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463, 913-U984 (2010).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Otsu, N. A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).
- Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. Single-cell gene expression profiling. Science. 297, 836-840 (2002).
- Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data. Plos Computational Biology. 6, (2010).
