Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon
Summary
TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.
Abstract
TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Yekpare geometrisi, 1.0 ila 5.0 ml hacim arasında değişen belirli bir pipet uçları için adapte edilebilir. Yekpare büyük gözenek kolayca minimum akışkan geri basınç ile geçmesine viskoz veya karmaşık örnekleri sağlar. Çift yönlü akış yekpare ve örnek arasında kalma süresi en üst düzeye çıkarır ve tek TruTip içinde işlenecek büyük örnek hacmi sağlar. Ne olursa olsun numune hacmi veya TruTip geometrinin temel adımlar, hücre lizisi TruTip yekpare iç gözenekleri bağlayıcı bir nükleik asit, bağlanmamış numune bileşenleri ve lisis tampon yıkayarak ve uygun bir tampon içine saflaştırılmış ve konsantre nükleik asitleri yıkanarak içerir. TruTip özelliklerini ve uyum bir Eppendorf epMotion 5070 kullanarak üç otomatik klinik örnek işleme protokollerinde gösterilmiştir, Hamilton STAR ve nazofarenks aspirat, kandan genomik DNA izolasyonu ve fetal DNA ekstraksiyon ve maternal plazma geniş hacimli (sırasıyla) den zenginleştirme RNA izolasyonu dahil olmak üzere STARplus sıvı taşıma robotlar,.
Introduction
Nükleik asit saflaştırma en moleküler tanı için, araştırma sadece kullanmak gereklidir ve yaşam bilimleri uygulamaları. Çeşitli yaklaşımlar fenol / kloroform ekstraksiyon işleminden itibaren ortaya çıkmıştır, bunun pek çok kaotropik tuzlar 1 mevcudiyetinde silika bağlama nükleik asidin temel ilkesine dayanmaktadır. Çıkarma işlemi (2-13 olarak örneklere bakın) dönüş filtreleri, manyetik boncuk ve yaşam bilimleri sektöründe hakim ilgili yaklaşımlar, çeşitli boncuk ve membran tabanlı biçimler aracılığıyla akıcı ve otomatik olmuştur. Etkili iken zorlu klinik matrisler ile karşı karşıya zaman, parçacıklar ve membranlar sınırlamalar tanıyoruz. Örneğin, membranlar ve boncuk tabanlı sütun uyumlu, küçük gözenek boyutları (böylece, yüksek karşı basınçlı) var ve bir santrifüj veya vakum sistemi tarafından işlenmesi için destek bir tür gerektirir. Zarlar, fiziksel özellikleri ve boncuk sütun sonuçverimli sarf ve / veya tek yönlü akış yolu ile işlenebilir toplam (giriş) örnek hacmi tıkanma olmadan işlenebilir örnekleri türünü sınırlar önemli akışkan direnci,. Tersine, manyetik parçacıklar çalkalama ile numune içinde dağıtılmalıdır. Homojen bir çözüm içinde manyetik parçacıkların dağıtmak için ihtiyacı en manyetik boncuk sarf malzemeleri ile işlenebilir toplam giriş örnek hacmi sınırlar. Klinik örnek özelliklerini (örneğin, viskozite ve karmaşıklık gibi), bir tüp veya çubuk tarafındaki verimsiz manyetik partikül konsantrasyonu yol açabilir. Buna ek olarak, silika ince partiküller kendi mıknatıslanma kaybetme ve son örnek kirlenmesine, çıkarma işlemi sırasında boncuk kapalı zarar verebilir.
TruTip teknolojisi, bu nükleik asit örnek işleme kısıtlamaları ve sınırlamaları 14 bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Bir içinde gözenekli bir yekpare gömerekpipet, akışkan geri basınç düşer, vakum (yani pipet aspirasyon) tarafından akış kontrolü sağlar hangi. Bu özellik, büyük ölçüde (Şekil 1) basitleştirilmiş zor örnek tipleri nükleik asitlerin arındırmak için gereken ekstraksiyon işlemi ve enstrümantasyon sağlar. Yekpare geometrisi ve gözenek yekpare kalınlığı 1.0 5,0 ml kadar numune hacimleri için yeterli nükleik asit bağlama kapasitesi sağlarken, tıkanma en aza indirmek için özel olarak tasarlanmıştır. Örnek aspirasyon ve dağıtım sırasında çift yönlü akışı örnek özü ve verimli nükleik asit kurtarma ve elüsyon için bağlayıcı yekpare arasında uzun süreli ikamet kez izin verir ve pipet kendi hacim kapasitesi aşan işlenecek nispeten büyük örnek hacmi sağlar. Daha önce tek veya çok kanallı Rai kullanarak nazofarenks örneklerinden grip RNA arındırıcı için bir el TruTip prosedürün geliştirme ve uygulama rapornin pipet 15. Eşdeğer ekstraksiyon verimleri 10 6 gen kopyaları da otomatik Qiacube ve manuel TruTip yöntemleri arasında influenza A ml başına nazofarengeal aspirat elde edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, yaygın referans klinik laboratuvarlarda bulunan sıvı taşıma robotlar kullanarak nazofarenks aspirat (NPA) ve diğer klinik örnek türleri için orta ve yüksek verimli, otomatik TruTip nükleik asit saflaştırma işlemleri, göstermekti.
Protocol
Representative Results
Discussion
TruTip kavramı ve iş akışı sadeliği (Şekil 1) bu kolay, otomatik verimli ve klinik örnek matrisleri, giriş numune hacimleri ve sıvı taşıma sistemleri bir dizi için etkili, adapte olun. Her klinik örnek benzersiz olduğunu, ancak, kabul edilmelidir, ve viskozite sonraki bir, parçacık, mukus, yüzey kirleticiler, mikrobiyal ve / veya insan genetik arka değişir. Klinik örnek kompozisyon ve otomatik bir TruTip örnek hazırlama protokolü kullanım amaçları beklenen değişimler göz önüne alındığında, bu nedenle belirli bir örnek türü için istenen sonuçları elde etmek için bir TruTip prosedürde bazı adımlar değiştirmek gerekli olabilir. Ne olursa olsun örnek türü, ancak, genellikle nükleik asit saflığı ve / veya kurtarma en önemli etkiye sahip TruTip parametreler şunlardır:
- Lizis tamponu (ve alkol) ile örnek karıştırma ve homojenizasyon. TruTips yeniden sahip olsa dalatively büyük gözenek boyutu, örnek homojenizasyon ve sıvılaşma verimli hücre parçalama için çok önemlidir, ve TruTip yekpare sonra bağlayıcı adımlar. Homojen ve iyi sıvılaştırılmış lizat ile, örnekler genel örnek işleme süresini azaltır yüksek akış oranları ile TruTip hareket edebilir. Büyük hacimli plazma protokolü büyük giriş örnek hacmi rağmen, iyice homojenize ve zor örnekleri (on-line veya off-line) sıvı hale kullanıcılar için potansiyel göstermektedir.
- Akış oranları. Yavaş akış oranları bir nükleik asit bağlayıcı bir veya yıkama sırasında tipik olarak toplam işlem süresi pahasına olsa da, daha yüksek nükleik asit verimi ile sonuçlanabilir. Yavaş akış oranları da DNA kesme ölçüde azaltabilir.
- Döngüsü numaraları. Optimum aspirasyon sayısı ve döngüleri dağıtmak numune tipi, toplam örnek hacmi ve akış hızı bağlıdır. Şekil 1, Adım 1, tipik olarak bir nokta olduğu döngü numbe ders (ve akış hızı) gibi farklı hastalardan nedeniyle NPA viskozite aralığına optimize etmek daha zor lizatları birini temsil nazofarenks aspirasyon (Şekil 5) gibi örnekleri ile, bazı ampirik optimizasyon gerektirebilir.
- Kurutma. TruTip yekpare tam kurutma saflaştırılmış nükleik asit örnek ve inhibe alt süreçleri ya da testleri ile birlikte salınımlı gelen artık organik çözücüler önlemek için zorunludur. TruTip santrifüj veya vakumlu filtrasyon yoluyla kurutuldu değildir, çünkü, bu kurutma adımı sırasında akım oranı ve döngü sayısı en üst düzeye çıkarmak için önemlidir. Bazen kurutma döngüsü tamamlandıktan sonra TruTip bir ucu üzerinde yıkama çözeltisinin bir damlacık kalıntı yoktur. Hamilton robot böylece solvent içermeyen elüsyon sağlanması, damlacık serbest bırakmak için iyi tarafında bir "ipucu dokunuş" gerçekleştirmek için yeteneğine sahiptir. EpMotion sistemi bu özelliği var, ama bir el içinde TruTip terminus ön durulama değilkirlenmesi tamponu, aynı etkiyi elde etmek için programlanabilir.
Robot kanal kollar için geometri, pipet malzeme ve ek yöntem her araç üreticisi için benzersiz olduğu için, farklı bir TruTip yapı her sıvı taşıma sistemi için gereklidir. TruTip monolit boyutları (çap, kalınlık ve gözenek boyutu) nükleik asit bağlama kapasitesi (ve yıkama verimliliği) ile ilişkili yok, herhangi bir katı-faz ekstraksiyon tekniği için bekleniyor. Kalın (> 4 mm) matrisler büyük hacimli örnekleri ve / için nükleik asit bağlama kapasitesinin artırılması ya da belirli TruTip biçimleri arasında bağlama kapasitesi eşitlemek için 1 ml TruTip içine gömülü olsa da, TruTip kalınlığı ve akış oranları arasında bir değiş tokuş sırasında orada ilk bağlama adımı (ham lizatları varlığında). Bu nedenle, otomatik bir protokolün ilk adımları için daha büyük hacimli pipet uçları içine büyük çaplı yekpare embed bazen avantajlıdır, (örneğin </ Em> büyük hacimli çekimi için 5 ml Hamilton / Akonni TruTips). Sıvı taşıma robot üreticileri tarafından dikte özel TruTip yapılandırmaları göz önüne alındığında, ancak, mutlaka TruTip nükleik asit verimleri farklı üreticilerin, veya farklı TruTip boyutları arasında sıvı taşıma platformlarında aynı olması için beklemeyin.
Normalde steril siteler (örneğin beyin omurilik sıvısı) elde sürece klinik örnekler (tanım olarak) insan genomik DNA önemli miktarda içerir. Diğer uygulamalarda, insan genomik DNA'sı, istenmeyen bir arka (Şekil 5 gibi) temsil etmektedir, bazen insan genomik DNA'sı, (Şekil 6'daki gibi) tercih edilir. Arka plan DNA varlığı, genellikle monolit bağlama kapasitesi aşmayacak numunedeki nükleik asidin toplam miktarının sürece sorun teşkil etmez, arka plan DNA'nın bir taşıyıcı olarak hizmet edebilir, istenen hedef nükleik halindeasit eser miktarda bulunur. Yüksek hacimli plazma çıkarma protokolü (Şekil 7) amacı, olması dışında bulaşıcı hastalık test edilen numune hazırlama amacı benzer anne bir DNA 10-20 kat fazla, mevcudiyetinde (bölünmüş) DNA fetal izole etmektir dizileri derece uyumlu olan ve sadece yüksek derecede spesifik moleküler testleri ve / veya boyut ayrımı ile ayırt edilebilir. Bu durumda, toplam DNA, dolaşımdaki 5 ml TruTip ve daha sonra yüksek molekül ve düşük molekül ağırlıklı DNA fetal yoluyla ayrılır kullanılarak izole edilir bağlama tamponu koşullar değiştirilerek, 1 ml'lik bir TruTip yapışmasından ve elüsyon. Bir silika yekpare kendi bağlanma ve elüsyon özelliklerine göre hedef nükleik asitlerin selektif boyut ayırma ve zenginleştirme zarlar ya da boyut dışlama spin sütunları ile elde göre hareket önemli ölçüde farklı bir moddur. Insan genomik DNA mikrobiyal DNA boyutu ayırma ve zenginleştirme bir olabilirTruTip bağlayıcı ve elüsyon tampon özelleştirme yoluyla gelecekte uygulamalarında ccomplished.
Otomatik protokolleri burada çeşitli klinik örneklerden işlenmesi için TruTip yekpare kendi yarar ve nasıl geniş hacimli ve belirli sıvı taşıma robotlar için adapte edilebilir vurgulamak gösterdi. Aerodinamik yöntemler genellikle diğer otomatik sistemlere göre daha hızlı çıkarma protokolleri neden. TruTip işlemleri otomatik hale getirmek için gerekli olan temel donanım pipet kanal kol kendisi yerine manyetik çubuklar, vakum sistemleri, çünkü TruTip teknoloji basitlik Ancak, aynı zamanda, yeni, otomatik nükleik asit arıtma sistemi satın alma ilgilenenler için bazı maliyet avantajı tanıyor , ya da on-board santrifüjler. Önceden doldurulmuş reaktif plakaları kullanan da alan ve gerekli sarf azaltmak ve çalışma başına verim iki katına çıkarabilir. TruTip protokolleri ile güverte alanı en aza indirmek de entegre gelişmiş olanak sağlar yukarı veya dTruTip ile ownstream otomatik işlemler. Örneğin damıtmak tam kan için Hamilton easyBlood çözümü önemli ölçüde biyo-bankacılık süreçlerini olur otomatik TruTip ekstraksiyon yöntemi ile dahil edilebilir. Bu nükleik asit kantitatif, normalleştirme, PCR set-up, ya da DNA dizi analizi gibi post-çıkarma işlemleri de kolayca büyük sıvı taşıma platformlarda TruTip ile entegre edilmiştir.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın bölümleri hibe R 44 AI072784 altında Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Kirsten St George, Sara B. Griesemer'ın, Daryl Lamson ve Viral Hastalıklar, Wadsworth Merkezi, sayısal grip virionların ve klinik-doğrulanmış influenza gerçek zamanlı erişim için Sağlık New York Eyaleti Bölümü Laboratuvarı Amy Dean teşekkür PCR.
Materials
| Reagent/Material | |||
| TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
| 95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| 99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
| DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
| Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
| Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
| epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
| Equipment | |||
| epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
| Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
| Reservoir rack | 960002148 | ||
| Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
| 95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| 1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
| 1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
| 50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
| Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
| Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
| 1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
| Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
| 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
| Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
| Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
| 96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
| 50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
| 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| 120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
| Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
| 5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| 120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| 50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
| 24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
| 32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
| Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |
Referencias
- Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
- Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
- Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).
- Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
- Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
- Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
- Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
- Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
- Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
- Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
- Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
- Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
- Belgrader, P. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , (2010).
- Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
- Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
- Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
- Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).
