TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. כתוצאה מכך, את תבנית הכנת המדגם תואמת למכשירי טיפול הנזילים ביותר, וניתן להשתמש בו למדיום רבים ליישומים קליניים תפוקה גבוהה וסוגי מדגם.
TruTip הוא טכנולוגית מיצוי חומצות גרעין פשוטה לפי מטריצה נקבובית, מונוליטי מחייבת מוכנסת לתוך קצה פיפטה. הגיאומטריה של מונולית יכולה להיות מותאמת לטיפים פיפטה ספציפיים הנעים בנפח 1.0-5.0 מ"ל. הנקבוביות הגדולה של מונולית מאפשר דגימות צמיגות או מורכבות בקלות לעבור דרכו עם backpressure fluidic מינימאלי. זרימה דו כיוונית למקסימום זמן מגורים בין מונולית והמדגמת, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים להיות מעובד בתוך TruTip אחת. את הצעדים הבסיסיים, ללא קשר לנפח דגימה או הגיאומטריה TruTip, כוללים תמוגה תא, חומצות גרעין מחייבים את הנקבוביות הפנימיות של מונולית TruTip, שטיפת רכיבי מדגם מאוגד וחוצצי תמוגה, ומשחררי חומצות גרעין מטוהרים ומרוכזות במאגר מתאים. את התכונות וההתאמה של TruTip הם הפגינו בשלושה פרוטוקולי עיבוד מדגם קליניים אוטומטיים באמצעות epMotion Eppendorf 5070, המילטון STAR ורובוטים טיפול נוזל STARplus, כוללים בידוד RNA מן לשאוב אף ולוע, בידוד הדנ"א הגנומי מדם כולו, ומיצוי DNA עוברי והעשרה מכמויות גדולות של פלזמה אימהית (בהתאמה).
טיהור חומצות גרעין היא הכרחית לאבחון המולקולרי ביותר, מחקר משתמש רק, ויישומים במדעי חיים. גישות שונות התפתחו מאז ימיו של עקירות פנול / כלורופורם, שרבים מהם מבוססים על עיקרון היסוד של חומצות גרעין מחייבים לסיליקה בנוכחות מלחי chaotropic 1. תהליך החילוץ התייעל ואוטומטי באמצעות השימוש בפורמטים מבוססי קרום חרוז ושונים, עם מסנני ספין מגנטיים, חרוזים וגישות הקשורות שולטות בתעשיית מדעי החיים (ראה דוגמאות ב2-13). אמנם יעיל, חלקיקים וקרומים ידעו מגבלות כאשר התעמתו עם מטריצות קליניות מאתגרות. לדוגמה, קרומים ועמודות מבוססות חרוז תואמים, יש לי גודל נקבובית קטן (ובכך, גב לחצים גבוהים), ודורש איזה סוג של תמיכה כדי להיות מעובד על ידי מערכת צנטריפוגות או ואקום. המאפיינים הפיסיים של קרומים ותוצאת עמודות בחרוזהתנגדות fluidic משמעותית, אשר מגבילה את הסוג של דגימות שניתן לעבד בצורה יעילה ללא סתימה מתכלה, ו / או נפח הדגימה הכולל (קלט) שיכול להיות חד כיוונית מעובד דרך נתיב הזרימה. לעומת זאת, חלקיקים מגנטיים חייבים להיות מופצים בכל רחבי המדגם על ידי תסיסה. צריך להפיץ חלקיקים מגנטיים homogenously במסגרת פתרון מגביל את נפח דגימת הקלט הכולל שיכול להיות מעובד עם חומרים מתכלים חרוז מגנטי ביותר. תכונות לדוגמה קליניות (כגון צמיגות או מורכב) יכולות להוביל לריכוז חלקיקים מגנטיים לא יעיל בצד של צינור או מוט. בנוסף, סיליקה חלקיקים זעירים יכולים לשבור את של החרוזים בתהליך החילוץ, מאבדים את המגנטיזציה שלהם ומזהמים את המדגם הסופי.
טכנולוגית TruTip פותחה כדי להתגבר על חלק מאילוצים אלה חומצות גרעין מדגם העיבוד ומגבלות 14. על ידי הטבעת מונולית נקבובית בתוךפיפטה קצה, backpressure fluidic הוא הוריד, המאפשר בקרת זרימה על ידי ואקום (כלומר שאיפת פיפטה). תכונה זו מאפשרת את תהליך החילוץ והמכשור הנדרש כדי לטהר את חומצות גרעין מסוגי מדגם קשים להיות פשוטים מאוד (איור 1). הגיאומטריה והנקבובית של מונולית מותאמת כדי למזער את סתימה, ואילו העובי של מונולית מספק קיבולת כבילה מספיק חומצות גרעין לכרכי מדגם נעים 1.0-5.0 מ"ל. זרימה דו כיוונית בזמן שאיפת מדגם והניפוק מאפשרת פעמים מגורים ממושכות בין תמצית המדגם ומונולית מחייבת להתאוששות חומצות גרעין יעילה וelution, ומאפשרת כרכי מדגם גדולים יחסית לעיבוד שתעלה את קיבולת הנפח של קצה פיפטה עצמו. אנחנו דיווחו על הפיתוח והיישום של הליך TruTip ידני לטיהור RNA שפעת מדגימות אף ולוע באמצעות ראי חד או רב ערוצים בעברנין pipettor 15. יעילות מיצוי מקבילה התקבלו בין אוטומטי QIAcube ושיטות TruTip הידניות ב 10 6 עותקי גן שפעת מ"ל לשאוב לאף ולוע. מטרת המחקר הייתה להדגים כיצד מתבצע פעולות לטווח בינוניות ותפוקה גבוהה, אוטומטיות TruTip חומצות גרעין לטיהור לשאוב אף ולוע (רשות טבע וגנים) וסוגי מדגם רלוונטיים קליני אחרים, שימוש ברובוטי טיפול נוזל נמצאים בדרך כלל בהתייחסות למעבדות קליניות.
הפשטות של מושג TruTip וזרימת העבודה (איור 1) להפוך אותו להתאים בקלות, אוטומטי, יעיל ואפקטיבי למספר מטריצות קליניות לדוגמה, כרכי מדגם קלט, ומערכות טיפול נוזל. יש להכיר בכך, עם זאת, כי בכל דגימה קלינית היא ייחודית, ומשתנה אחד למשנהו בצמיגות, חלקיקים, ליחה, משטח מזהמים, חיידקים, ו / או רקע גנטי אנושי. בהתחשב וריאציות צפויות בהרכב מדגם קליני ושימושים מיועדים של פרוטוקול הכנת מדגם TruTip אוטומטי, זה עשוי להיות לכן, יש לשנות את שלבים מסוימים בהליך TruTip על מנת להשיג תוצאות רצויות עבור סוג מדגם מסוים. ללא קשר לסוג המדגם, לעומת זאת, TruTip פרמטרים שיש להם השפעה המשמעותית ביותר על טוהר חומצות גרעין ו / או התאוששות כוללים בדרך כלל:
בגלל הגיאומטריה, חומר קצה פיפטה, ושיטת ההצמדה לזרועות רובוטיות הם הערוץ ייחודיים לכל יצרן מכשיר, מבנה TruTip שונה נדרש עבור כל מערכת טיפול נוזלית. ממדי מונולית TruTip (קוטר, עובי וגודל נקבובית) אין לתאם עם יכולת קשירת חומצות גרעין (ויעילות elution), כצפוי לכל טכניקת מיצוי שלב מוצקה. אמנם עבה (> 4 מ"מ) מטריצות עשויות להיות מוטבעים TruTip 1 מ"ל להגדלת קיבולת מחייב חומצות גרעין לדגימות גדול בנפח ו / או להשוות את יכולת הקשירה על פני פורמטי TruTip ספציפיים, יש איזון בין עובי TruTip וספיקות במהלך הצעד המחייב הראשוני (בנוכחות lysates הגולמי). לכן, זה לפעמים יתרון להטביע פסלים גדול בקוטר לטיפי פיפטה בנפח גדול יותר לצעדים הראשונים של פרוטוקול אוטומטי, (לדוגמה: </ Em> 5 מ"ל TruTips המילטון / Akonni לעקירות בהיקפים גדולים). בהתחשב בתצורות TruTip הספציפיות המוכתבות על ידי היצרנים של רובוטים טיפול נוזל, לעומת זאת, אנחנו לא מצפים בהכרח תשואות חומצות גרעין TruTip להיות זהות על פני פלטפורמות טיפול נוזל מיצרנים שונים, או על פני גדלי TruTip שונים.
דגימות קליניות (על פי הגדרה) יכילו כמויות משמעותיות של הדנ"א הגנומי אדם אלא אם כן הם נרכשו מבדרך כלל אתרים סטריליים (נוזל השדרה מוחין לדוגמה). לפעמים הדנ"א הגנומי האדם הוא רצוי (כמו באיור 6), ואילו ביישומים אחרים ה-DNA האנושי מייצגת רקע גנטי לא רצוי (כמו לאיור 5). נוכחותו של ה-DNA הרקע היא בדרך כלל לא בעייתית, כל עוד הסכום הכולל של חומצות גרעין במדגם אינו עולה על יכולת הקשירה של מונולית, ואת ה-DNA הרקע יכול לשמש כספק אם גרעין היעד הרצויחומצה מצויה בכמויות זעירות. המטרה של פרוטוקול חילוץ הפלזמה בנפח גבוה (איור 7) היא לבודד (מקוטע) ה-DNA העוברי בנוכחות עודפת של פי 10-20 של ה-DNA האימהי, שהוא דומה למדגם האובייקטיבי הכנת בדיקות מחלות זיהומיות פרט לכך הרצפים חופפים מאוד וניתן להבחין רק על ידי בדיקה ספציפית מאוד מולקולרית ו / או אפליה גודל. במקרה זה, ה-DNA במחזור הכוללת היא מבודדת באמצעות 5 מ"ל TruTip, וה-DNA העוברי במשקל מולקולרי גבוהה ונמוכה מולקולרי הבא מופרדים באמצעות כבילה שלאחר מכן וelution לTruTip מיליליטר 1 על ידי שינוי תנאי המאגר המחייבים. הפרדת גודל סלקטיבית והעשרה של חומצות גרעין המבוססות על יעד מחייבם ומאפייני elution למונולית סיליקה היא מצב שונה באופן מהותי מפעולה מושגת על ידי קרום או עמודות ספין גודל הרחקה. הפרדה והעשרה של גודל ה-DNA של חיידקים מהדנ"א הגנומי אדם עשויה להיותccomplished ביישומים עתידיים באמצעות התאמה אישית מחייב TruTip ומאגרי elution.
הפרוטוקולים האוטומטיים הפגינו כאן מדגישים את התועלת של מונולית TruTip עצמו לעיבוד דגימות קליניות שונות, ואיך זה יכול להיות מותאם לכמויות גדולות ורובוטים טיפול נוזל ספציפיים. השיטות יעילה בדרך כלל לגרום לפרוטוקולי חילוץ מהירים יותר בהשוואה למערכות אוטומטיות אחרות. הפשטות של טכנולוגית TruTip, לעומת זאת, גם מעניקה כמה יתרונות עלות למי שמעוניין ברכישת מערכת חדשה, אוטומטי טיהור חומצות גרעין, משום שהחומרה העיקרית הנדרשת למיכון תהליכי TruTip היא זרוע פיפטה הערוץ עצמו ולא מוטות מגנטיות, מערכות ואקום , או על לוח צנטריפוגות. ניצול צלחות מגיב מראש מלאות יכול גם להפחית את השטח ומתכלה נדרשים, ולהכפיל את התפוקה לכל טווח. צמצום שטח סיפון עם פרוטוקולי TruTip גם מאפשר למשתמשים מתקדמים לשילוב במעלה הזרם או דתהליכים אוטומטיים ownstream עם TruTip. לדוגמא פתרון easyBlood של המילטון לדם כל fractionate יכול להיות משולב עם שיטת חילוץ TruTip האוטומטית, אשר הייתי לייעל באופן משמעותי את התהליכים ביו בנקאיים. תהליכים שלאחר המיצוי כגון quantitation חומצות גרעין, נורמליזציה, PCR ההגדרה, או רצפי DNA גם משולבים בקלות עם TruTip על פלטפורמות טיפול נוזל הגדולות יותר.
The authors have nothing to disclose.
חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) במסגרת המענק R 44 AI072784. אנו מודים לד"ר קירסטן סנט ג'ורג', שרה ב 'Griesemer, דריל Lamson ואיימי דיקן המעבדה למחלות ויראליות, Wadsworth Center, מחלקת מדינת ניו יורק בריאות לשפעת virions לכמת וגישה קלינית לתוקף שפעת בזמן אמת מבחני ה-PCR.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |