عزل السائل المخي الشوكي من أجنة القوارض للاستخدام مع إإكسبلنتس مشرح القشرية الدماغية
Summary
السائل المخي الشوكي البطين (CSF) والاستحمام عصبية ظهارية الدماغية القشرية الخلايا الاصلية خلال نمو المخ في وقت مبكر من الجنين. نحن هنا وصف الأسلوب وضعت لعزل CSF البطين من أجنة القوارض من مختلف الأعمار للتحقيق وظيفتها البيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن لدينا تشريح الدماغ يزدرع القشرية وتقنية ثقافة تسمح للنمو يزدرع مع وحدات التخزين أدنى من ثقافة المتوسط أو CSF.
Abstract
وCSF هو السائل معقدة مع بروتيوم متفاوتة خلال مراحل تطوره وحيوي في مرحلة البلوغ. خلال التطور الجنيني، ويفرق CSF الوليدة من السائل الذي يحيط بالجنين عند إغلاق أنبوب للالعصبية الأمامية. CSF حجم يزيد على مدى الأيام اللاحقة ثم والخلايا المبطنة للعصبية ظهارية السلف البطينين والمشيمية الضفيرة CSF تولد. والجنينية للاتصالات CSF قمي سطح البطين، من الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ والحبل الشوكي النامي. CSF يوفر حاسمة ضغط السائل لتوسيع الدماغ النامية وتوزع النمو إلى عوامل هامة لتيسير الخلايا الاصلية العصبية بطريقة محددة زمنيا. للتحقيق في وظيفة CSF، فمن المهم لعزل عينات نقية من التلوث CSF الجنينية دون من الدم أو الأنسجة النامية الدماغ الانتهائي. هنا، نحن تصف تقنية لعزل عينات نقية نسبيا من البطين الجنينية CSF التي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من المقايسات التجريبية بما في ذلك مطياف الكتلة، الكهربي البروتين، والخلية الأولية والثقافة يزدرع. نحن لشرح كيفية تشريح والثقافة إإكسبلنتس القشرية على الأغشية المسامية البولي من أجل أن تنمو الأنسجة القشرية النامية مع وحدات التخزين من وسائل الإعلام أو انخفاض CSF. مع هذا الأسلوب، يمكن إجراء التجارب باستخدام CSF من مختلف الأعمار أو شروط للتحقيق في النشاط البيولوجي للبروتيوم CSF على الخلايا المستهدفة.
Introduction
وCSF هو السائل الذي يغمر في مجمع الظهارة العصبية النامية 1-6 و يقدم الضروري 7 الضغط وتعزيز النمو العظة للدماغ النامية 8-12. لدراسة CSF على مدى نمو الدماغ، وضعنا تقنيات لعزل CSF البطين من تطوير الفئران أو الماوس الأجنة أثناء مراحل مختلفة من التنمية 6،9. وشملت الأساليب السابقة من العزلة باستخدام الزجاج الصغيرة إبر وعزل CSF باستخدام محقن الصغير 1،2. لدينا أسلوب يستخدم الزجاج الصغيرة الشعرية ماصة التي تم سحبها تلميح لإنشاء نقطة متناهية الصغر لاختراق الأنسجة المحسنة. توصيل الزجاج الصغيرة الشعرية ماصة لالشافطة حتى يمكن التحكم CSF أن جمع البطين مع التغيرات في ضغط لطيف. للتحقيق في تأثيرات الخلايا الجذعية من الإشارات CSF، ونحن تشريح إإكسبلنتس القشرية الدماغية، ووضعها على الأغشية البولي، وتطفو بها على مكعب المناسبةlture المتوسطة تستكمل مع عينات CSF 9. مع هذه التقنية، وحجم خفض من وسائل الإعلام كافية لثقافة الأنسجة، مما يسمح لكفاءة استخدام CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أسفرت الطريقة الموضحة لجمع عينات CSF البطين نقية نسبيا من CSF الجنينية مع تكوين البروتين مستقرة والنشاط المستمر في عدد من المقايسات الخلوية 9. مع تقنية جمع القمامة وحجم جيدة من عشرة E14.5 الفئران، ويمكن للمرء أن يتوقع لجمع 10-15 ميكرولتر من CSF، ومن القمامة من الفئرا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدعم من المعاهد الوطنية للصحة (أرقام جائزة R00 NS072192 لMKL، HD029178 لAS.L.، و 2 RO1 NS032457 لCAW). MKL وهو حاصل على شهادة الطفل مستشفى بوسطن للتنمية زمالة / زمالة كلية طب شور مدرسة وزميل في مؤسسة ألفرد سلون P.. CAW هو باحث في معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
Referencias
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Biología del desarrollo. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Biología del desarrollo. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Biología del desarrollo. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
