Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Fortgeschrittenen Technologien bedingter Genmanipulation in der Maus zu ermöglichen vielfältige Ansätze zur Exploration von synaptischen Bahnen und funktionelle Verbindungen im zentralen Nervensystem. Transgene können durch niedermolekulare Effektoren wie Doxycyclin Einwirken auf ein Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator, die für den Einsatz als Repressor oder Aktivator der Gentranskription, oder Tamoxifen Erkennen eines mutierten Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors ¹ funktionieren kann geregelt werden . Irreversible Modifikation Transgen wird üblicherweise von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Rekombinasen erreicht. Cre (Ursachen Rekombination) und Flp (Flippase Rekombinationsenzyms) katalysieren die Exzision, Inversion oder Translokation von DNA-Fragmenten, die von loxP (locus der Kreuzung x über, P1) oder Frt (Flippase Anerkennung target) Seiten bzw. ¹ flankiert werden. Zu den Anwendungen gehören Gen-Aktivierung oder Inaktivierung und induzierbare Ribonukleinsäure (RNA) Störungen <sup> 2. Bedingungsausdruck von fluoreszierenden oder enzymatischen Reporter wie β-Galactosidase oder alkalischer Phosphatase verwendet werden, um Neuronen beschriften und prüft ihre topische Organisation und Konnektivität ³ werden. Large-scale Mutagenese-Projekte in Nordamerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) und Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produzieren Bibliotheken embryonalen Stammzellen der Maus Zellklone mit bedingten Gen-Targets und Fallen, die letztlich auf das gesamte Maus-Genom. Mäuse aus diesen Klonen erzeugt werden, können mit einer wachsenden Zahl von Maus Linien gekreuzt werden, daß DNA-Rekombinasen exprimieren unter Promotoren oder Loci für eine bestimmte Population von Neuronen zur selektiven Genmanipulation ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).

<p class= "Jove_content"> Allerdings kann die Beschränkung auf Genmanipulation unterschiedliche Populationen von Neuronen oder bestimmten Regionen von Interesse nicht durch genetische Targeting allein, wenn ein Promotor spezifisch für die Neuronenpopulation von Interesse nicht bekannt ist und nicht von allen Neuronen in der Region exprimiert erreicht werden von Interesse. Im Rückenmark können experimentellen Designs erfordern räumlichen Beschränkung der Genmanipulation ein oder zwei kraniokaudalen Segmente. Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, Cre oder Flp drückt ermöglicht Begrenzen Genrekombination in Regionen im Rückenmark von Mäusen, in denen DNA-Fragmente von loxP-oder FRT-Stellen flankiert sind, so genannte floxed oder flrted Allelen. Anders als konstitutive DNA-Umlagerung, die würde aus Kreuzungen der Tiere mit Rekombinase exprimierenden Mäusen führen, diese Strategie auch zeitliche Kontrolle über Gen-Aktivierung oder Inaktivierung. Virale Vektoren kodieren gefloxten oder geflirtet Transgene bieten eine umgekehrte Möglichkeit Genmanipulation in Mäusen, die corresponding Rekombinase stromabwärts eines Neuron-spezifischen Promotors. Mehrere rekombinante Vektoren mit Affinität zu Neuronen sind ^4. Hochleistungs-(gutless) Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes simplex-Virus und Lentivirus-Vektoren werden üblicherweise neurotropen verwendet. Die Auswahl des geeigneten Virus für eine Fragestellung ist ein wichtiger Teil des experimentellen Designs. Größe des Transgens, Lieferroute, Spezifität der Infektion mit Neuronen, um Gliazellen, Infektion Wirksamkeit, entzündlichen und toxische Nebenwirkungen müssen berücksichtigt werden ⁴ entgegengesetzt.

Hier beschreiben wir die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors in der dorsalen Horn des Rückenmarks, eine Technik, die wir verwenden zur bedingten Genregulation in unserer Forschung über die Neurobiologie von Schmerz. Das Hinterhorn erhält afferenten Input von primären somatosensorischen Neuronen einschließlich nozizeptiven Neuronen. Lokale Interneurone verarbeiten die Informationen vor der Projektion Neuronen vermitteln sie ausdas Hinterhorn des Gehirns ^5. Wir demonstrieren die Infektion von Dorsalhorn spinalen Neuronen an Segmentebene L4 mit einem neurotropen rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), das verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) drückt unter einem konstitutiv aktiven CMV-Promotors.