Генерация распределенные пресомитной мезодермы клеточных культур для работы с изображениями данио рерио Сегментация часы в одиночных камерах
Summary
Сомитогенеза является ритмичный процесс развития, что пространственно модели оси тела эмбрионов позвоночных. Ранее мы разработали трансгенных данио линии, которые используют флуоресцентные журналистам соблюдать циклические гены, которые управляют этим процессом. Здесь мы культура рассеяны клетки от этих линий и изображение их колебаний с течением времени в пробирке.
Abstract
Сегментация является периодической и последовательной морфогенетический процесс у позвоночных. Это ритмическая формирование блоков ткани называемых сомиты вдоль оси тела свидетельствует о генетической генератора паттерна развивающийся эмбрион. У рыбок данио, внутриклеточный часы вождения сегментации состоит из членов Ее / Hes фактора транскрипции семьи организованной в отрицательные петель обратной связи. Недавно мы генерируется трансгенных флуоресцентных репортер линии для циклического гена HER1 что резюмировать пространственно-временную структуру колебаний в пресомитной мезодермы (PSM). Используя эти линии, мы разработали систему культуры в пробирке, который позволяет в режиме реального времени анализ сегментации тактовых колебаний в отдельных, изолированных клеток PSM. Удаляя PSM ткани из трансгенных эмбрионов, а затем диспергирования клетки от колеблющихся регионы на стеклянным дном блюда, мы получили культур, пригодных для покадровой визуализации сигнала флуоресценции ототдельные часы клетки. Такой подход обеспечивает экспериментальную и концептуальную основу для прямого манипулирования сегментации часы с беспрецедентным разрешением одноклеточных, что позволяет его свойства клеток-автономной и ткани на уровне следует отличать и расчленены.
Introduction
Периодическое формирование сегментов вдоль позвоночных оси тела, или сомитогенеза, свидетельствует о пространственной и временной осциллятора в развивающемся эмбрионе. Благоприятствования механизм управления сомитогенеза концептуально описывается "часами и волнового фронта" модели 1, в котором "часы", состоящий из сотовых осцилляторов, сейчас считается, что внутри клетки обусловлен ритмической экспрессии набора циклических генов 2, клещей от образования из сомиты от пресомитной мезодермы (PSM). По мере развития эмбриона, созревание "волнового фронта" в PSM движется согласованно с регресс ткани по направлению к задней, замедляя и арестовывать сотовые осцилляторы, как она проходит 3. Все вместе это пространственно-временной динамическая система называется сегментации часы. Современные подходы для изучения сегментации SPAN тактовой три повышение уровня организации от генетического осциллятора в одиночных камерах в местные го связина происходит между клетками и, наконец, к глобальному регулированию позиционной информации в коллективном PSM ткани 4.
Предыдущие исследования показали, клетка-автономная сегментация генератор у рыбок данио состоит из генов и белковых продуктов из ее / HES транскрипции factorfamily, который, как считается, образуют отрицательной обратной связи через репрессии транскрипции 5-7. Сигнальный путь Delta / Notch синхронизирует колебания между соседними клетками и регулирует коллективный период населения 8-10. Fgf сигнальные молекулы, производимые в хвостовой почки появляются построить градиент через данио PSM, и тем самым предположили, внести свой вклад в замедление и арестовывать колеблющиеся клеток в передней 11. До сих пор функциональная роль каждого из этих молекул в сомитогенеза не были исследованы генетической мутации, инъекции морфолиногруппой, теплового шока избыточная экспрессия, и антагонистом наркотиков TREAtment тактовых компонентов и сигнализации между клетками 5,7,10,12. Используя эти возмущения, сегментация функция часы были выведены из описания ткани уровня сомитных дефектов и потери однородных колебаний в выражении циклических генов как HER1, her7 и дельты С. Тем не менее, почти все из этих данных со стационарных эмбрионов и не в состоянии точно фиксировать изменения, которые присущи динамической функции сегментации часы. Совсем недавно, с несколькими эмбрион покадровой визуализации показал первые мутанты с периода измененного осциллятора, но эти наблюдения были также сделаны на уровне ткани 7,13. Таким образом, поведение предполагаемого клеточно-автономным генератором во время сомитогенеза не наблюдалось.
Статические снимки сомитогенеза дать неполную картину, поскольку, по сути, процесс приводится в движение колебательной системы. Ранее работа в мыши и куриных клеток показали, что уровни стенограммыи повышение белка и осенью, но выборки примерно 2 часов колебаний каждые 30 или 45 минут обязательно ограничивает данные, собранные и, следовательно, выводы, которые можно сделать 14,15. Изучение других биологических осцилляторов, в первую очередь, циркадные часы, отошла от постановочных измерений гена и экспрессии белка в режиме реального времени мониторинг с помощью флуоресцентной и биолюминесцентных журналистам 16,17. Эти средства необходимы для демонстрации часы свойства отдельных клеток 18. Биолюминесцентное корреспондент Hes1 циклического гена была разработана и кратко характеризуется в единичных мыши PSM клеток 19. Средний период и отклонение были рассчитаны для небольшого числа клеток, показывающий, что колебания сохраняться в течение нескольких циклов в пробирке. Однако эти исследования не количественном отношении стабильности и надежности частоты генератора и амплитудой, будь клетки могут спонтанно входа или выхода колебания,и как клетки сохраняют свои фазовые соотношения. Кроме того, эффекты сигнальных молекул, обнаруженных в эмбрионе на часах клеточно-автономными не были протестированы непосредственно. Следовательно, эти фундаментальные свойства одиночного осциллятора клеток остаются совершенно неизвестно.
Недавно мы разработали трансгенных рыб линий с использованием ВАС recombineering 20 ездить Венера (YFP) флуоресценции журналистам из HER1 выражения 30. Такие линии использовать регуляторные сигналы от интактной хромосомного локуса в которую они встроены и воспроизводят временную динамику и пространственное распределение HER1. Этот прорыв позволяет для мониторинга в режиме реального времени экспрессии генов в развивающихся эмбрионов рыбок данио в естественных условиях. Для изучения фундаментальных свойств клеточных автономных колебаний и, как такое выражение регулируется с течением времени, мы недавно разработали надежный метод, чтобы изолировать и записи из PSM клеток в пробирке. Это протоцв описывает, как мы использовали наши трансгенных репортер линии для создания распределенных клеточных культур, из которых мы можем охарактеризовать колебания данио сегментации часы в одиночных камерах. Мы можем, таким образом, решить нерешенные вопросы в области, которые не были доступны со статическим или ткань уровня анализа, а также напрямую управлять сегментации часы на одном уровне клетки с сигнальных молекул и ингибиторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изучения клеточный процесс, который происходит в течение эмбрионального развития, биологи обычно используют подход в контексте всей эмбриона. Однако, чтобы полностью понять, как одна клетка ведет себя в развития сроки, способ изучить и возмущают отдельные клетки в изоляции также весьма полезным. Создавая дисперсные клеточных культур PSM с использованием трансгенных эмбрионов рыбок данио у нас теперь есть инструмент непосредственного изучения клеток автономный характер генетических колебаний в сегментации часов в количественном виде. Это можно измерить динамику колебаний в нашей флуоресцентного репортера в сотни клеток при различных условиях.
Наблюдаемое период одиночных клеток в культуре длиннее, чем период сомитогенеза в интактном эмбриона. Заметим, что нетронутыми ПСМ эксплант в культуре также проявляет более медленные колебания, чем интактной эмбриона (данные не представлены), предполагая, тхат длительный период наблюдается в изолированных клетках не просто из-за ущерба от разгона. Переменная период и амплитуда наблюдается в большинстве наших одноклеточных временных рядов. Источником этой изменчивости, неизвестно, но должны выявить важные детали о темпе решений схем сегментации часов камеры.
С помощью этого метода можно изучать генетические компоненты сегментации на клеточном уровне, и решения вопросов, которые являются достаточно сложными для изучения во всем эмбриона. Например, контролируемым добавлением известных сигнальных молекул, обнаруженных в развивающегося эмбриона до наших культур, мы можем рассмотреть их воздействие на одной сотовой PSM осциллятора в надежной и воспроизводимой анализа. Наша система культуры ПСМ открывает дверь к точной оценки, какие факторы, по отдельности или в комбинации способствовать колебания в этих клетках, какие факторы тормозят эти колебания, и, чтобы проверить взаимодействие между таких молекул. С помощью этих инструментов в руках, мы стремимсяоценить существующие модели сомитогенеза, которые основаны на опубликованных данных тканей уровня, а также использование приводит одиночных клеток для создания предсказания, которые могут быть проверены в целом эмбриона.
Насколько нам известно, это первый данио протокол первичной культуры клеток при остром покадровой записи флуоресценции в одиночных камерах; дальнейшее развитие и совершенствование этого протокола нет сомнений возможно. Другие протоколы часто используют эмбрионы рыбок данио для генерации стабильных клеточных линий, которые могут быть трансфицированных с журналистами и используемые для долгосрочного изображений 27-29. В то время как стабильные линии полезны для визуализации процесса, которая не привязана к срокам разработки, такие как циркадных часов, вопрос о эмбрионального сегментации требует немедленного картину звучания и клетки все еще находятся в колебательной, государства-предшественника. После того, как клетки прекращают колеблющаяся, они предполагают дифференцированный судьбу клетки, а когда в ткани, будут включены в сомита. Это роssible, что при правильном фактора или факторов, присутствующих в пробирке мы могли генерировать ПСМ-как данио клеточных культур линии, которые остались бы колебательная, значительно позволяет долгосрочных наблюдений, несколько последовательных возмущения или высокопроизводительного скрининга.
Мы ожидаем, что этот способ получения первичных культур рассеянных клеток для покадровой обработки изображений хорошо подходит для изучения любого сотового процесс, который происходит в течение развития временных рамок, которые не доступным с использованием стабильных данио клеточных линий. Выделение различных типов клеток в различных стадиях развития из соответствующих трансгенных репортеров линий, либо через рассечение или через FACS после эмбрионального диссоциации, может обеспечить начальные клетки. Некоторые оптимизация условий культивирования, руководствуясь эмбрионального происхождения клеток, которые могут потребоваться. Комбинируя этот гибкий и чувствительный протокол с быстро растущей коллекции трансгенных даниолинии, мы надеемся способствовать пробирке биологии развития подхода в том, что является дополнением к классической генетических и эмбриологических методов.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана EMBO длительных стажировок (ABW), Национальный научный фонд Международный Докторантура исследовательский грант (ABW), Макс Планк Gesellschaft (ABW, DS, JS, АКН), роет-ВВ стипендий (АО), и Европейский исследовательский совет под Европейских сообществ Седьмая Рамочная программа STG-207634 (DS, АКН). Мы благодарим Рави Десаи за полезные замечания по рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить экспрессии белка-центр MPI-ЦБС для производства данио Fibronectin1 фрагмента, персонала рыба объекта MPI-ЦБС для ухода и обслуживания наших рыбных линий и MPI-ЦБС световой микроскопии объекта для поддержки визуализации.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
Referencias
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. Quantitative approaches in developmental biology. Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo’s Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (1126).
