단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성
Summary
Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.
Abstract
분할은 척추 동물의주기 순차적 형태 발생 과정이다. 몸의 축을 따라 somites라는 조직의 블록이 리듬 형성은 배아를 패터닝 유전 발진기의 증거입니다. 제브라 피쉬에서, 세포 내 시계 구동 조각은 음의 피드백 루프로 구성 그녀 / 신은 전사 인자 가족의 구성원으로 구성되어 있습니다. 우리는 최근 presomitic 중배엽 (PSM)의 진동의 시공간적 패턴을 요점을 되풀이주기 유전자 HER1에 대한 형질 전환 형광 기자 라인을 생성했다. 이러한 라인을 사용하여, 우리는 하나의 절연 PSM 세포 내에 분할 클록 진동의 실시간 분석을 허용 시험 관내 배양 시스템을 개발 하였다. 유전자 변형 배아에서 PSM 조직을 제거하고 유리 바닥 요리에 영역을 진동 세포를 분산함으로써, 우리는 형광 신호의 시간 경과 이미징에 적합한 문화를 생성각각의 시계 세포. 이 방법은 세포 자치와 조직 수준의 속성을 구분하고 해부 할 수 있도록 전례없는 단일 셀 해상도로 분할 시계의 직접 조작에 대한 실험과 개념적 프레임 워크를 제공합니다.
Introduction
척추 동물의 몸 축, 또는 somitogenesis 따라 세그먼트의주기적인 형성, 배아의 공간과 시간 발진기의 증거입니다. somitogenesis을 제어 애용기구는 개념적 이제 세포 내 환상 유전자 2 세트의 리듬 표현에 의해 구동되는 것으로 생각 셀룰러 발진기 이루어진 "시계", 형성 떨어져 틱 상기 "시계 및 파면"모델 1에 의해 설명된다 의 somites presomitic 중배엽 (PSM)에서. 배아 발달로, PSM의 성숙 "파면"는 둔화 있고 그것을 통과 세포 발진기를 체포, 후방을 향해 되돌아가는 조직과 협력하여 이동합니다. 함께,이 시공간 동적 시스템 분할 시계라고합니다. 분할 시계 범위에서 현지 커플 링 번째로 하나의 세포에있는 유전자 발진기에서 조직의 세 증가 수준을 공부하는 현재의 접근 방식에서 세포 그리고 마지막으로 집단 PSM 조직 4 위치 정보의 글로벌 규제 사이에 발생합니다.
이전 연구는 제브라 피쉬의 셀 자치 분할 발진기는 전사 억제 5-7을 통해 음의 피드백 루프를 형성하기 위해 생각됩니다 factorfamily 그녀 / HES 전사에서 유전자와 단백질 제품으로 구성하는 것이 좋습니다. 델타 / 노치 신호 전달 경로가 이웃하는 셀 사이의 진동을 동기화하고 인구의 8-10 집단 기간을 조절한다. tailbud에서 생산 FGF 신호 전달 분자는 제브라 피쉬의 PSM에 걸쳐 그라데이션을 구축하기 위해 나타나고, 이에 따라 전방 (11)에 진동 세포를 둔화 및 체포에 기여하는 가정합니다. 지금까지 somitogenesis에서 이러한 분자의 각각의 기능적인 역할은 유전자 변이, 모르 폴리 노 주입, 열 충격을 통해 표현하고 길항제 약물 세차장에 의해 조사 된시계의 구성 요소와 세포 5,7,10,12 사이의 신호의 tment. 이러한 섭동을 사용하여 분할 시계 기능은 조직 수준의 체절 결함의 설명과 HER1, her7, 델타 같은주기 유전자의 발현에 균일 한 진동의 손실에서 유추 된 C. 그러나, 거의 모든 데이터는 고정 된 배아에서하고 정확하게 분할 클록의 역동적 함수에 내재 된 변경을 캡처하지 못한다. 최근 여러 배아 시간 경과 영상은 변경된 발진기 기간이 첫 번째 돌연변이를 밝혀 왔지만, 이러한 관찰은 또한 조직 수준 7,13에서 만들어졌다. 따라서, somitogenesis 동안 가정 세포 자치 발진기의 동작은 관찰되지 않았습니다.
본질적으로, 프로세스가 진동 시스템에 의해 구동되기 때문 somitogenesis의 정적 스냅 샷은 불완전한 그림을 제공합니다. 마우스와 병아리 세포의 이전 작업은 보여 주었다 성적 수준단백질의 상승 및 하강하지만, 약 2 시간의 진동마다 30 ~ 45 분을 샘플링은 반드시 수집 된 데이터와 14, 15을 그릴 수있는, 따라서 결론을 제한합니다. 다른 생물 발진기의 연구는, 특히, 일주기 시계는 실시간 형광 및 발광 생물 기자 (16, 17)를 사용하여 모니터링 멀리 유전자 및 단백질 발현의 단계적 측정에서 이동했습니다. 이러한 도구는 하나의 셀 (18)의 시계 속성을 보여 필수적입니다. HES1주기 유전자의 발광 생물 기자 개발 간단히 하나의 마우스 PSM 셀 (19)을 특징으로하고있다. 평균주기 및 차이는 진동이 시험관 내에서 여러 사이클 지속되었음을 보여 세포의 소수에 대해 계산 하였다. 그러나, 이들 연구는 정량적으로 세포가 저절로 시작하거나 종료 진동 할 수 있는지 여부, 오실레이터 주파수 및 진폭의 안정성과 견고성을 해결하지 않았다방법 및 세포는 그들의 위상 관계를 유지한다. 또한, 세포 자치 시계의 배아에있는 신호 분자의 효과를 직접 테스트 된 것은 아닙니다. 따라서, 단일 세포 발진기의 이러한 근본적인 특성은 전혀 알려지지 남아있다.
우리는 최근에 HER1 식 (30)의 금성 (YFP) 형광 기자를 구동하기 위해 BAC의 recombineering (20)를 이용하여 형질 전환 어류 라인을 개발했습니다. 이러한 라인은 매립 및 시간적 역학 HER1의 공간적 패턴을 다시 요약되는 본래 염색체 유전자좌의 규제 신호를 악용. 이 획기적인 생체 현상 제브라 피쉬 배아에서 유전자 발현의 실시간 모니터링을 허용한다. 기본적인 세포 자율 진동의 특성과 방법 등의 표현이 시간이 지남에 따라 규제를 연구하기 위해, 우리는 최근 체외에서 PSM 세포에서 분리하여 기록 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 개발했다. 이 프로토COL은 우리가 하나의 셀에 제브라 피쉬 분할 시계의 진동 특성을 할 수있는 분산 된 세포 배양을 생성하기 위해 유전자 변형 기자 라인을 활용 한 방법을 설명합니다. 우리는 따라서 뛰어난 정적 또는 조직 수준 분석 접근 없었던 분야의 문제뿐만 아니라 직접 신호 분자와 억제제와 단일 세포 수준에서 세그멘테이션 시계를 조작을 해결할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배아 발달의 과정을 통해 일어나는 세포 과정을 연구하기 위해, 생물 학자들은 일반적으로 전체 배아의 맥락에서 접근 방식을 사용합니다. 그러나, 완벽하게 하나의 세포가 발달 시간 내에 작동하는 방식을 이해하기 위해, 검사 및 격리에 각각의 세포를 교란 할 수있는 방법은 매우 유용합니다. 형질 전환 제브라 피쉬 배아를 사용하여 분산 된 PSM 세포 배양을 생성하여 우리는 이제 직접 정량적 인 방법으로 분할 시계 유전 진동의 세포 자율적 인 특성을 연구 할 수있는 도구가 있습니다. 그것은 다양한 조건 하에서 세포 수백 트립 형광 리포터에서 진동의 역학을 측정 할 수있다.
문화에서 하나의 세포의 관찰 기간은 그대로 배아에서 somitogenesis 기간보다 더 길다. 우리는 문화에 그대로 PSM 이식편도 그쪽을 제안, 그대로 배아 (데이터가 표시되지 않음)보다 느리게 진동을 나타내는 것을 관찰T 고립 된 세포에서 관찰 된 이상 기간이 분산 손상 단순히 때문이 아니다. 가변주기와 진폭은 우리 단세포 시계열의 대부분에서 관찰된다. 이 변화의 원인은 알 수 있지만, 분할 시계의 속도 결정 회로에 대한 중요한 정보를 공개해야한다.
이 방법으로 우리는 전체 태아 검사에 도전하는 유전자 세포 수준에서 분할의 구성 요소 및 주소 문제를 공부할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 문화에 배아에서 발견 알려진 신호 전달 분자의 제어뿐만 아니라, 우리는 강력하고 재현 분석에서 하나의 PSM 휴대 발진기에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 우리의 PSM 문화 시스템은 이러한 진동을 억제하는 요인이 무엇인지, 혼자, 인자, 또는 조합이 세포의 진동을 촉진 무엇의 엄격한 평가에 문을 열고, 같은 분자 사이의 상호 작용을 테스트 할 수 있습니다. 손에 이러한 도구를 사용, 우리가 목표로전체 배아에서 시험 될 수 예측을 생성하기 위해 하나의 셀에서 출판 조직 수준의 데이터뿐만 아니라, 이용 실적에 기초 somitogenesis의 기존 모델을 평가한다.
우리의 상식으로,이 단일 세포에서 형광의 급성 시간 경과 기록에 대한 최초의 제브라 피쉬의 기본 세포 배양 프로토콜입니다; 이 프로토콜의 추가 개발 및 개선을 할 수 의심의 여지가있다. 다른 프로토콜들은 종종 기자 형질 장기 촬상 27-29 사용될 수 안정된 세포주를 생성하기 위해 제브라 피쉬 배아를 사용한다. 안정적인 라인 등의 일주기 시계로 개발 타이밍에 연결되지 않은 프로세스를 이미징 유용하지만 세포가 진동, 전구 상태에 아직도있는 동안, 배아 분할의 문제는 즉시 영상을 필요로한다. 세포는 진동을 중지하면, 그들은 조직에서, 체절에 통합 될 때 분화 된 세포의 운명을 가정합니다. 그것은 PO이다오른쪽 인자 또는 관내에 존재하는 요인과 우리가 크게 장기 관찰, 여러 개의 연속 교란, 또는 높은 처리량 검사를 가능하게 진동 남아있을 PSM 같은 제브라 피쉬의 세포 배양 라인을 생성 할 수 있음을 ssible.
우리는 시간 경과 이미징에 분산 된 세포의 차 문화를 준비하는이 방법은 안정 제브라 피쉬의 세포 라인을 사용하여 가까이하지 않는 개발 기간 내에 발생하는 세포 과정의 연구에 적합합니다 기대합니다. 해부를 통해 또는 FACS를 통해 하나의 해당 유전자 변형 기자 라인에서 뚜렷한 발달 단계에서 서로 다른 세포 유형의 분리는 배아 분리 한 후, 시작 세포를 제공 할 수 있습니다. 세포 배아 기원에 의해 안내 배양 조건, 몇몇 최적화가 요구 될 수있다. 형질 전환 제브라 피쉬의 빠르게 성장하는 컬렉션이 유연하고 민감한 프로토콜을 결합하여라인, 우리는 고전적인 유전 학적 방법을 보완 체외 발달 생물학의 접근을 용이하게하는 것을 희망한다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 EMBO 장기 교제 (ABW)에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 국제 박사 학위 취득 후 연구 활동 (ABW), 막스 플랑크 먼 (ABW, DS, JS, ACO), 파고-BB의 교제 (AO), 및 (ACO DS) 유럽 공동체 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 STG-207634에서 유럽 연구위원회. 우리는 원고에 도움이 코멘트 라비 데 사이 감사합니다. 우리는 또한 제브라 피쉬 Fibronectin1 조각, 관리 및 우리의 물고기 라인과 영상 지원을위한 MPI-CBG 광학 현미경 시설의 유지 보수를 위해 MPI-CBG 물고기 시설 직원의 생산을위한 MPI-CBG 단백질 발현 시설 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
Referencias
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