Skive kulturer lette manipulering av embryo utvikling av genet og farmakologiske forstyrrelser. Imidlertid må dyrkningsbetingelser at normal utvikling kan fortsette innenfor redusert miljø av stykket. Vi illustrere en protokoll som muliggjør normal ryggmarg utvikling å fortsette i minst 24 timer.
Skive kulturer kan lette manipulering av embryo utvikling både farmakologisk og gjennom genet manipulasjoner. I denne reduserte systemet, kan potensielle dødelige bivirkninger på grunn av systemisk stoffet applikasjoner bli overvunnet. Imidlertid må dyrkningsbetingelser sikre at normal utvikling provenyet innenfor redusert miljø av stykket. Vi har fokusert på utvikling av ryggmargen, særlig det av spinal motor nevroner. Vi systematisk variert kultur forhold kylling embryo skiver fra det punktet hvor de fleste spinal motor nevroner hadde blitt født. Vi analysert antall og type av motoriske nevroner som overlevde i kulturperiode og posisjonen av de motoriske nevroner i forhold til at in vivo. Vi fant at serum type og neurotrofiske faktorer ble kreves under kulturperiode og var i stand til å holde motor nevroner live i minst 24 timer og tillate de motoriske nevroner å migrere til hensiktsmessige stillinger iryggmargen. Vi presentere disse kultur forhold og metodikk for å forberede embryo skive kulturer bruker eviscerated kyllingembryoer innebygd i agarose og skiver med en vibratome.
Under normal embryo utvikling, er mange forskjellige celletyper generert som må migrere fra deres synspunkt opprinnelse til hvor de vil til slutt fungere i den modne organismen. Innenfor utvikle ryggmargen, er stamceller som ligger i den ventrikulære sonen på midtlinjen og generere mange undertyper av postmitotic nevroner og gliaceller som må migrere å integrere i funksjonelle nevrale kretser som kreves for sensorisk prosessering og motorutganger en. Spinal motor nevroner som kontrollerer sammentrekning av lem muskler har blitt grundig studert, og mye er kjent av molekylene og mekanismer som driver dannelsen av deres forskjellige underklasser. Det er imidlertid mye mindre kjent av mekanismer som motor nevroner vandrer, skille og motta synaptiske innganger.
Motor neuron subtype identitet er ervervet under utvikling i et hierarkisk måte. Motor Nevron subtyper kan grovt klassifiseres into distinkte søyler, divisjoner og bassenger som er definert av sine axon anslag. Motor kolonner prosjektet aksoner til enten aksial, visceral eller lem muskler. Motor divisjoner dele opp lem prosjektering motor nevroner i lateral motor kolonnen (LMC) inn i de prosjektering til ventral eller dorsal muskler 2. Innenfor divisjonene, kalt klynger av motoriske nevroner motor bassenger prosjektet til enkelte muskler i ben 2, 3. Limb-prosjektering motor nevroner er definert av deres uttrykk for transkripsjonsfaktor 4 Foxp1, 5, mens avdelings identitet er preget av uttrykket av de homeodomain transkripsjonsfaktorer Islet-1 (ventrally prosjektering) eller Lhx-1 (dorsally prosjektering) 6. Faktisk er Lhx-1 uttrykk som kreves for de aktuelle dorsal projeksjoner av motoren nevroner 7. Hver av disse subtypene okkupere forskjellige stillinger i ryggmargen, ventral prosjektering motor nevroner kommer til å ligge mediale til dorsally projecting motor nevroner. Dette resulterer i LMC blir segregert i såkalte LMCmedial (LMCm) og LMClateral (LMCl) divisjoner. Avdelte og motor pool organisasjon er ervervet i to faser 8. I den første fasen, er avdelings segregering oppnås via en migrering av motoriske nerveceller i en karakteristisk mediale til laterale mote. De LMCl celler genereres etter LMCm celler og så LMCl vandrer gjennom LMCm å oppnå sin endelige settling posisjon. Den andre fasen tar motoriske nevroner i en divisjon og klynger dem inn motor Nevron bassenger, antagelig via en dorsal-ventral sortering av motoriske nerveceller. Medlemmer av catenin-avhengige klassisk cadherin familie har blitt vist seg å være avgjørende for begge faser av motor Nevron organisasjon 8-10. Men hvordan er cadherin funksjonen kontrollerer celle bevegelse dårlig forstått.
Oppkjøpet av columnar, avdelte og basseng identiteter krever ytre signaler som mønster intrinsic uttrykk for transkripsjonsfaktorer 11. I tillegg, rundt 50% av alle motoriske nevroner dør via apoptose under normal utvikling i en prosess som krever ytre signaler fra lem, hovedsakelig gjennom neurotrophic støtte av motor Nevron overlevelse. Dermed krever motoriske nervecellen utvikling riktig miljø for å bli opprettholdt over en relativt lang tidsforløpet. Av denne grunn, de praktiske generere ryggmargen skive kulturer for å opprettholde motor Nevron overlevelse krever klarlegging av aktuelle kultur forhold. Tidligere embryo skive kulturer har blitt brukt til å følge oppførselen til extrinsically lagt renset nevronale populasjoner 12-14. Imidlertid har våre kunnskaper kultur forhold som letter in situ motor neuron overlevelse og migrasjon innenfor sektoren selv ikke publisert. Vi modifisert en standard kultur tilstand som letter overlevelse renset, til dissosierte cranial motoriske nevroner lette mOTOR neuron utvikling innen et embryo stykke kultur-systemet. Vi også overvåket plasseringen av de overlevende motoriske nevroner og vise at hovedsakelig normale posisjoner av motoriske nevroner divisjoner er ervervet under kulturperiode.
Protokollen er beskrevet her gjør en kylling embryo stykke å bli inkubert i mer enn én dag mens du holder motor nevroner i live og fortsette å migrere under kultur perioden. I belyse forholdene for å holde motor nevroner i live, har vi identifisert flere viktige funksjoner som kreves. Det ser ut til at opptil 4% chick serum er avgjørende for overlevelsen av motoriske nevroner og dens erstatning med serum fra en annen art er ikke tolerert. Interessant, fant vi at tilstedeværelsen av høyere konsentrasjoner av serum var skadelig for sektorene som de fremmet overvekst av vev fører til brutto skjevheter i stykke figuren. Enda viktigere, tilstedeværelse av cilliary neurotrophic faktor også vist kritisk. Det gjenstår en distinkt mulighet for at skivene kan være i stand til å bli dyrket i betydelig lengre perioder enn bare 24 timer, kanskje til og med slik at visualisering av sensorisk afferent input til ryggmargen. Tillegg, culture forholdene her kan også være nyttig å skjære kulturer i utviklingsland hjernestammen og midthjernen / lillehjernen.
Kanskje den største potensielle fordelen i bruken av disse skive dyrkningsbetingelser er at de lette muligheten for farmakologisk manipulering av protein funksjon samtidig minimere potensialet for uønskede effekter på resten av embryoet, som hjertet. Et stort antall inhibitorer og agonister av ulike signalveier kan brukes til å vurdere den migrering av forskjellige spinal neuron subtyper og eventuelt deres virkning av dannelsen av lokale spinal kretser under utviklingen. I tillegg, noen genetiske perturbasjoner av protein ekspresjon, slik som de som gjør bruk av siRNAs og morfolino oligonukleotider, lider av det faktum at de bare kan bli introdusert tidlig i utviklingen (grunnet begrensninger ii ovo electroporation prosedyrer) og effektene bare vare en kort periode time (typisk en dag). Vår stykke kultur startes på senere stadier og gir muligheten til å bruke denne teknologien senere i utviklingen på slicing scenen for å vise sine effekter i løpet av kulturen i stykket.
Stykket kultur protokollen kunne også tillate visualisering av både spinale motoriske nevroner samt dorsal interneuron migrasjon i sanntid via time-lapse video mikroskopi. Dette kan oppnås ved hjelp av fasekontrast mikroskopi under hvitt lys eller gjennom bruk av fluorescens-avbildning. Hvis sistnevnte teknikken skulle brukes deretter innføring av fluorescerende etiketter er nødvendig. Dette kan oppnås enten ved innføring av fluorescerende fargestoffer som Dii eller dio via enten retrograd merking fra lem eller anterograd merking fra ventrikkelen eller ovo elektroporering av konstruksjoner for å drive fluorescerende proteiner i en undergruppe av nerveceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Sharon Skryt for mange innsiktsfulle diskusjoner og B. Novitch for den type gave av antistoff mot Foxp1. Dette arbeidet som finansieres av en studieplass fra Wellcome Trust til KCT og et prosjekt stipend fra Wellcome Trust til SRP (Grant referansenummer 094399/B/10/Z).
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |