Lokalisering og fordeling af proteiner giver vigtige oplysninger for at forstå deres cellulære funktioner. Den overlegne rumlig opløsning af elektronmikroskopi (EM) kan anvendes til at bestemme den subcellulære lokalisering af et givet antigen efter immunohistokemi. Til væv i centralnervesystemet (CNS), at bevare strukturel integritet under opretholdelse af antigenicitet er særlig vanskeligt i EM-studier. Her, vælger vi en fremgangsmåde, der har været anvendt til at bevare strukturer og antigener i CNS til undersøgelse og karakterisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner.
Immunoelektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at studere biologiske molekyler på det subcellulære niveau. Antistoffer koblet til elektrontætte markører såsom kolloidalt guld kan afsløre lokaliseringen og fordelingen af specifikke antigener i forskellige væv 1. De to mest anvendte teknikker er før indlejring og efter indlejring teknikker. I præ-indlejring immunogold-elektronmikroskopi (EM) teknikker, skal vævet permeabiliseres for at tillade antistof penetration før det er indlejret. Disse teknikker er ideelle til konservering strukturer, men dårlig penetration af antistoffet (ofte kun de første få mikrometer) er en væsentlig ulempe 2. De post-indlejring mærkningsmetoder kan undgå dette problem, fordi mærkningen finder sted på sektioner af faste væv, hvor antigener er mere let tilgængelige. I årenes løb er et antal modifikationer forbedret efter indlejring metoder til at øge immunreaktivitet og bevare ultrastruktur <sup> 3-5.
Vævsfiksering er en afgørende del af EM undersøgelser. Fikseringsmidler kemisk tværbinde makromolekylerne at låse vævsstrukturer på plads. Valget af fixativ påvirker ikke kun strukturel konservering, men også antigenicitet og kontrast. Osmiumtetroxid (OSO 4), formaldehyd og glutaraldehyd har været standard fiksativer i årtier, herunder for det centrale nervesystem (CNS) væv, der er særlig tilbøjelige til strukturelle skader i løbet af kemisk og fysisk behandling. Desværre er OSO 4 er meget reaktiv og har vist sig at maskere antigener 6, hvilket resulterer i dårlig og utilstrækkelig mærkning. Alternative metoder til at undgå kemisk fiksering omfatte frysning af væv. Men disse teknikker er vanskelige at udføre og kræver dyre instrumenter. For at løse nogle af disse problemer og forbedre CNS-væv mærkning, Phend et al. erstattet OSO 4 med uranylacetat (UA) og garvesyre ACId (TA), og med held indført yderligere ændringer for at forbedre følsomheden af påvisning af antigen og strukturel bevarelse i hjerne og rygmarv væv 7. Vi har vedtaget denne osmium-fri post-embedding metode til at rotte hjernevæv og optimeret immunogold mærkning teknik til at opdage og studere synaptiske proteiner.
Vi præsenterer her en fremgangsmåde til bestemmelse af ultrastrukturelle lokalisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner. Vi bruger organotypiske hippocampal dyrkede skiver. Disse skiver bevare trisynaptic kredsløb i hippocampus, og er således særligt anvendelige til at studere synaptisk plasticitet, en mekanisme bredt menes at ligge til grund for indlæring og hukommelse. Organotypiske hippocampale snit fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere 8, og er især nyttige til akut knockdown eller overudtrykker exogene proteiner. Vi har tidligere brugt denne protokol til characterize neurogranin (Ng), et neuron-specifikt protein med en kritisk rolle i reguleringen af synaptiske funktion 8,9. Vi har også anvendt den til at karakterisere den ultrastrukturelle lokalisering af calmodulin (CaM) og Ca2 + / CaM-afhængige proteinkinase II (CaMKII) 10. Som illustreret i de resultater, denne protokol giver mulighed for god ultrastrukturelle bevarelse af dendritiske Torner og effektiv mærkning af Ng at hjælpe karakterisere sin distribution i ryggen 8. Endvidere kan denne fremgangsmåde, har bred anvendelighed i at studere mange andre proteiner involveret i neuronale funktioner.
I denne protokol, har vi vedtaget Phend og Weinberg metode til hjerne og rygmarv væv til at studere dendritiske Torner i rotte hippokampalskivekulturer. Dendrit udløberne i hippocampus CA3-CA1 område er sarte strukturer, der indeholder en bred vifte af proteiner, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af neuronale funktioner. I denne procedure giver en afbalanceret tilgang til at opnå øget antigenicitet under opretholdelse af god ultrastrukturelle præservering (figur 2A), hvilket tillade…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Matthew Firenze til fremstilling af de hippokampalskivekulturer. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra US National Institute on Aging og Alzheimerforeningen til NZG.
NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |