Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l'hippocampe cultures Slice

Immunoélectromicroscopie est un outil puissant pour étudier les molécules biologiques au niveau subcellulaire. Anticorps couplés à des marqueurs denses aux électrons tels que l'or colloïdal peut révéler la localisation et la distribution des antigènes spécifiques dans différents tissus ^1. Les deux techniques les plus utilisées sont des techniques de pré-enrobage et de post-intégration. En pré-enrobage immuno-microscopie électronique (EM) techniques, le tissu doit être perméabilisées pour permettre la pénétration d'anticorps avant d'être embarqué. Ces techniques sont idéales pour la préservation des structures, mais la faible pénétration de l'anticorps (souvent, seuls les quelques premiers micromètres) est un inconvénient considérable ^2. Les méthodes de marquage post-enrobage peut éviter ce problème, parce que l'étiquetage se fait sur des coupes de tissus fixes où les antigènes sont plus facilement accessibles. Au fil des ans, un certain nombre de modifications ont permis d'améliorer les méthodes de post-enrobage à améliorer l'immunoréactivité et de préserver l'ultrastructure <sup> 3-5.

La fixation des tissus est un élément essentiel des études EM. Fixateurs chimiquement réticuler les macromolécules pour verrouiller les structures tissulaires en place. Le choix du fixateur affecte non seulement la préservation mais aussi structurelle antigénicité et le contraste. Tétroxyde d'osmium (OsO _4), le formaldéhyde et le glutaraldéhyde ont été les fixateurs standards depuis des décennies, y compris pour le système nerveux central (SNC) des tissus qui sont particulièrement exposés à des dommages structurels au cours de traitement chimique et physique. Malheureusement, OsO ₄ est très réactif et a été montré pour masquer les antigènes ^6, résultant en mauvais étiquetage et insuffisante. Des approches alternatives pour éviter la fixation chimique comprennent le gel des tissus. Mais ces techniques sont difficiles à réaliser et nécessitent des instruments coûteux. Pour résoudre certains de ces problèmes et d'améliorer l'étiquetage des tissus du système nerveux central, Phend et al. remplacé OsO ₄ avec de l'acétate d'uranyle (UA) et tannique acid (TA), et introduit avec succès des modifications supplémentaires pour améliorer la sensibilité de détection de l'antigène et de préservation de structure dans le cerveau et les tissus de la moelle épinière ^7. Nous avons adopté cette osmium sans post-intégration méthode aux tissus du cerveau de rat et d'optimiser la technique de marquage immunologique pour détecter et étudier les protéines synaptiques.

Nous présentons ici une méthode pour déterminer la localisation ultrastructurale des protéines synaptiques dans l'hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1. Nous utilisons organotypiques d'hippocampe en culture tranches. Ces tranches de maintenir le circuit trisynaptic de l'hippocampe, et sont donc particulièrement utiles pour l'étude de la plasticité synaptique, un mécanisme largement considéré comme sous-tendent l'apprentissage et la mémoire. Organotypiques de coupes d'hippocampe postnatales jour 5 et 6 souris / rat chiots peuvent être préparés comme décrit précédemment ^8, et sont particulièrement utiles pour effet de choc aiguë ou surexpriment les protéines exogènes. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour characterize neurogranine (Ng), une protéine spécifique des neurones avec un rôle critique dans la régulation de la fonction synaptique ^8,9. Nous avons aussi utilisé pour caractériser la localisation ultrastructurale de la calmoduline (CaM) et Ca ^{2 +} / CaM-dépendante protéine kinase II (CaMKII) ^10. Comme le montrent les résultats, ce protocole permet une bonne préservation ultrastructurale des épines dendritiques et d'étiquetage efficace de Ng pour aider à caractériser sa distribution dans la colonne ^8. En outre, la procédure décrite ici peut avoir une large applicabilité dans l'étude de nombreuses autres protéines impliquées dans les fonctions neuronales.