Near Infrared Optical Projection Tomography für Assessments von β-Zellen Massenverteilung im Diabetes Research
Summary
Wir beschreiben die Anpassung der optischen Projektions-Tomografie (OPT)<sup> 1</sup> Zur Bildgebung in der nahen infraroten Spektrum, und die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen. Diese Protokolle ermöglichen Einschätzungen von Pankreas-β-Zellmasse (BCM) in größeren Exemplaren, erhöhen Sie die Mehrkanal-Fähigkeit der Technik und erhöhen die Qualität der OPT-Daten.
Abstract
Durch Anpassung OPT, um die Fähigkeit der Bildgebung im nahen Infrarot (NIR)-Spektrum umfassen, wir hier zeigen die Möglichkeit, größere Körper Bild von Pankreasgewebe, wie Ratten Pankreas, und um die Anzahl von Kanälen (Zelltypen), die möglicherweise erhöhen in einer einzelnen Probe untersucht werden. Wir beschreiben die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen, die vorsehen: 1 / genaue Positionierung eines Prüflings (in unserem Fall die Bauchspeicheldrüse) Zentrum der Masse (COM) an der Rotationsachse (AR) 2, 2 / verbesserte Algorithmen zur Post Tuning-Ausrichtung, die geometrische Verzerrungen verhindert während der tomographischen Rekonstruktion 2 und 3 / ein Protokoll für Intensitätsangleichung um Signal-Rausch-Verhältnisse in OPT-basierte BCM Bestimmungen 3 zu erhöhen. Darüber hinaus beschreiben wir einen Probenhalter, die das Risiko für ungewollte Bewegungen der Probe minimiert während der Bildaufnahme. Zusammen ermöglichen diese Protokolle Einschätzungen der BCM Vertriebs-und other bietet, um im gesamten Volumen des intakten Pankreas oder in anderen Organen (zB in Studien von Inseltransplantation) durchgeführt werden, mit einer Auflösung bis auf die Ebene einzelner Langerhans-Inseln.
Introduction
Die Insulin produzierenden β-Zellen sind der Schlüssel für die Fähigkeit des Körpers, um den Blutzucker-Homöostase zu kontrollieren. Daher sind Einschätzungen von Pankreas BCM Vertriebs unbedingt viele Bereiche der prä-klinischen Diabetesforschung. In Auswertungen von therapeutischen Regimes zum Beispiel die Auswirkungen der gezielten Genablation auf endokrine Zelldifferenzierung oder Studien von Diabetes Ätiologie in Tiermodellen für die Krankheit oft auf solche Analysen ab. Traditionell sind diese Arten von Bewertungen, die auf zeitaufwendig stereologische Ansätze schwer aufgrund der Größe und komplexen anatomischen Konstitution des Pankreas führen sind verlassen. Die meisten hochauflösende Bildgebung Ansätze zur Zeit (in der Regel optisch), bieten keinen ausreichenden Eindringtiefe gesamte Bauchspeicheldrüse Bildgebung bei Nagetieren zu ermöglichen. Umgekehrt bieten bildgebenden Verfahren, die nicht durch ihre Eindringtiefe (typischerweise nuklearen) beschränken sich auf schlechte Auflösung, um die volle BCM Verteilung zu lösen und werden behindertdurch den Mangel an geeigneten Kontrastmittel 4,5.
Optische Projektion Tomographie ist ein 3D-Bildgebungsverfahren, die hochauflösende Einschätzungen der biomedizinischen Proben können auf dem mm-bis cm-Skala 6. Hiermit können auch Informationen über die räumliche Lage und das Volumen des einzelnen Insulin exprimieren Langerhans-Inseln über das gesamte Volumen der Bauchspeicheldrüse in normalen und diabetischen Mäusen 3,7-10 extrahiert werden. Das Ziel der vorliegenden Studie ist zur weiteren Verbesserung der Fähigkeit dieser Technik für die Beurteilung von pankreatischen β-Zellen; ihrer endogenen Verteilung, wenn sie in anderen Geweben, ihrer Beziehung zu anderen Pankreas Bestandteile (wie infiltrierenden Zelltypen) und in größeren gepfropften Pankreas-Präparate als bisher möglich.
Die Nah-Infrarot-optischen Projektion Tomographie (NIR-OPT) setup
In der unten Protokolle, eine OPT-Scanner auf dem ursprünglichen Satz durch Sharpe beschriebenen Basis <em> et al 1, angepasst, um Bildgebung im nahen Infrarotbereich wird beschrieben und eingesetzt. Für einkanalige Beurteilungen der Bauchspeicheldrüse der Maus (zB von BCM), kann der SkyScan 3001 (Bioptonics)-Scanner verwendet werden.
Metallhalogenidlampe, die höher ist als Anregungsenergie einer Quecksilberbogenlampe bietet bei Wellenlängen über 650 nm, liefert das Anregungslicht. Das Licht wird durch eine Flüssigkeit Lichtleiter übertragen. Eine sinnvolle Kombination von Farbstoffen und Bandpass-Filter für NIR Fluoreszenz-Bildgebung und Kanaltrennung sind in Abbildung 3 dargestellt. Das emittierte Licht wird mit einer Rückseite beleuchtet CCD-Kamera detektiert, mit hohem Quantenwirkungsgrad im NIR-Spektrum. Das OPT Scannen automatisiert über eine LabView-Plattform, die die Kamera steuert und Schrittmotor. Proben, die in der Größe von intakten Ratten Pankreas, einem geschützten versilberten Spiegel und einem großen Küvette unterstützt wird. Schließlich wird ein Probenhalter, die beseitigt unerwünschte vertikale movements der Probe während der Untersuchung wurde entworfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Techniken für OPT Bildgebung ermöglicht die Extraktion von räumlicher und quantitativen Parameter über das gesamte Volumen des murinen Bauchspeicheldrüse. Aufgrund von Einschränkungen in erreichbare Auflösung für diese Art der bildgebenden mesoskopischen ist anzumerken, dass wie bei den meisten bildgebenden Verfahren, je größer die Probe je niedriger die Auflösung (Obwohl die Verwendung einer höheren Auflösung CCD sollte die Auflösung des OPT Scan erhöhen) . Daher ist für die Beurteilung der intakten Pankreas Maus Lappen, wird die Technik zur Zeit keine einzelne Zelle Auflösung obwohl schließen (ca. 15-20 um) 7. Doch für die Extraktion von BCM Verteilung in der Maus Bauchspeicheldrüse die Protokolle Daten, die mehr als gut übereinstimmen, die vom Zählen zB Punkt Morphometrie 3,13 erhaltenen Es sollte angemerkt werden, dass, obwohl vorgesehen Durchführung des CLAHE Protokoll ermöglicht zum Nachweis von signifikant mehr Inselchen Diese Inseln sind meist kleiner und nicht Beitragte im Wesentlichen den gesamten β-Zellen Bände.
Die immunhistochemischen Protokollen beteiligt sind relativ lange (bis zu zwei Wochen), aber die eigentlichen Hände auf Zeit für die Probenvorbereitung ist kurz und somit die Technik ist gut für die Untersuchung von großen Kohorten von Tieren 9 geeignet. Wenn das Potential der heterogenen Verteilungsmuster ist ein Schwerpunkt für die Untersuchung, darauf hinzuweisen, dass Pflege in den Maßnahmen sollten ergriffen werden über Fixierung und Montage zu vermeiden, dass das Pankreasgewebe wird in ungünstiger Weise fixiert und eine flache ("ausgebreitet" werden ) mount des Gewebes sollte für solche Prüfungen erleichtern angestrebt werden.
Ein wichtiger Punkt bei der Durchführung von OPT ist, dass die Probe COM an der Drehachse befestigt ist, und dass es nicht zu bewegen, entweder vertikal oder horizontal, während des Scanvorgangs. Daher ist es wichtig, eine stabile mechanische Aufbau und ein gut funktionierendes System zur attachi habenng der Probe. Wir lösten dieses Problem, indem er eine neue Halterung (Abbildung 7).
Parallelgeometrie stimmte nicht für unsere NIR-OPT oder Bioptonics 3001-Scanner, der als vertikale Verschiebung zwischen der hinteren und vorderen Stellungen der peripheren Objekten in den Projektionsbildern aufgezeichnet erkannt wurde. Durch Einstellen des Objekts Source Abstand in der Log-Datei des jeweiligen Scanners (siehe 2.3.1) konnten wir deutlich verbessern die Qualität unserer Daten und korrigieren für geometrische Verzerrungen an den weit Kanten der Projektionsfläche Bilder, die von besonderer Bedeutung ist, wenn Beurteilung größeren Exemplaren.
In dem aktuellen Protokoll, bieten wir einen Vorschlag von Filter-Sets, die Visualisierung von drei verschiedenen spezifischen Kanälen und einer "Anatomie"-Kanal bei der Beurteilung der intakten Pankreas Präparate ermöglichen. Offensichtlich sind diese Einstellungen können angepasst werden, um besser auf die Fluorochrome für eine gegebene Studie zwar genutzt, wie bei allen Formen der Fluoreszenzcent Mikroskopie, sollte die potenzielle Gefahr des Signals Durchbluten sorgfältig evaluiert werden. Die Studie von Insulin markierten Inselchen mit Fluorochromen, die oberhalb von 750 nm angeregt werden noch nicht von uns mit dem Metallhalogenidlampe dass unsere Einrichtung nutzt möglich. Es ist möglich, dass eine Kamera mit noch höheren Quantenausbeute in den entsprechenden Wellenlängen in Kombination mit alternativen Lichtquellen (zB Diodenlasern) könnte das Potential der NIR-OPT weiter steigern und damit zur Bildgebung bei noch höheren Wellenlängen.
OPT-Bildgebung ist eine sehr vielseitige Technik zur räumlichen und quantitative Einschätzungen der biomedizinischen Probe auf dem mm-cm-Skala. Obwohl die hier präsentierten Protokolle für den Hauptzweck Bauchspeicheldrüse / Diabetesforschung entwickelt wurden sie sollte möglich sein, die Forschung an anderen Spezies, Probentypen und Marker zu übersetzen. Durch die Möglichkeit, mehrere verschiedene Kanäle in intakten Pankreas Vorbereitungen visualisieren, NIR-OPT Bildgebung feitere birgt das Potenzial als ein Werkzeug, um die Aufnahme Spezifität von Kontrastmitteln für die nicht-invasive Einschätzungen anderen bildgebenden Verfahren, solange diese Kontrastmittel gestalten könnte zu tragen auch eine Fluorophor nachweisbar OPT werden soll auszuwerten.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. P. Lindström ist für die Bereitstellung ob / ob Mäusen bestätigt. J. Lehtonen ist für die Unterstützung bei Video-Produktion und J. Gilbert für die Hilfe bei Bearbeitung anerkannt. (JS und: Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem Diabetes Research Institute Foundation (AP), der Juvenile Diabetes Research Foundation (AP and UA), der Europäischen Kommission (. CP-IP 228933-2 FP-7, Zuschussvereinbarung no) unterstützt UA), die Kempe Foundations, Umeå University und dem schwedischen Forschungsrat UA
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
Referencias
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- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
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