وصفنا تكييف التصوير المقطعي الإسقاط الضوئي (الأراضي الفلسطينية المحتلة)<sup> 1</sup> لتصوير في طيف الأشعة تحت الحمراء القريب، وتنفيذ عدد من الأدوات الحاسوبية. هذه البروتوكولات يتسنى إجراء عمليات التقييم الشامل من خلايا البنكرياس β (BCM) في عينات أكبر، وزيادة قدرة متعددة من هذه التقنية وزيادة جودة البيانات الأراضي الفلسطينية المحتلة.
الأراضي الفلسطينية المحتلة من خلال تكييف لتشمل القدرة على التصوير في الطيف القريب (NIR) الأشعة تحت الحمراء، ونحن هنا توضيح إمكانية الهيئات بشكل اكبر من الأنسجة البنكرياس، مثل الفئران البنكرياس، وزيادة عدد القنوات (أنواع الخلايا) التي قد دراسة في عينة واحدة. وصفنا كذلك تنفيذ عدد من الأدوات الحاسوبية التي تقدم: المواقع 1 / دقيقة من المركز (في حالتنا البنكرياس) عينة من كتلة (COM) في محور الدوران (AR) 2، 2 خوارزميات / محسنة لآخر الانحياز الذي يمنع التشوهات ضبط هندسية خلال اعادة تصوير الشعاعي الطبقي 2 و 3 / بروتوكول لمعادلة لزيادة كثافة إشارة إلى نسب الضوضاء في قرارات BCM الأراضي الفلسطينية المحتلة على أساس 3. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف حامل العينة أن يقلل من خطر الإصابة الحركات غير المقصودة للعينة خلال الحصول على الصور. معا، هذه البروتوكولات يتسنى إجراء عمليات التقييم والتوزيع الغير BCMميزات إيه، التي يتعين القيام بها في جميع أنحاء حجم بنكرياسات سليمة أو الأجهزة الأخرى (على سبيل المثال في دراسات زرع جزيرة)، مع دقة وصولا الى مستوى الجزر الفردية لانجرهانز.
إنتاج الأنسولين β-الخلايا هي المفتاح لقدرة الجسم على السيطرة على توازن الجلوكوز في الدم. ولذلك، وتقييمات التوزيع BCM البنكرياس أمر لا بد منه إلى مناطق عديدة من البحث السكري ما قبل السريرية. في تقييم الأنظمة العلاجية على سبيل المثال، فإن تأثير الجينات الاجتثاث التي تستهدف تمايز الخلايا أو الغدد الصماء دراسات المسببات المرضية السكري في نماذج القوارض لهذا المرض غالبا ما تعتمد على مثل هذه التحليلات. تقليديا، اعتمدت هذه الأنواع من التقييمات بشأن النهج stereological الوقت طويلا يصعب على أداء نظرا لحجم والدستور التشريحية المعقدة في البنكرياس. العلي النهج التصوير في الوقت الحاضر القرار (البصرية عادة)، لا توفر ما يكفي من عمق الاختراق للسماح كله التصوير البنكرياس في القوارض. وعلى العكس، والنهج التصوير التي لا تقتصر على عمق الاختراق من قبل (عادة النووية) تقدم إلى الفقراء القرار لحل الكامل وتوزيع BCM إعاقة وبسبب عدم وجود عوامل التباين كافية 4،5.
التصوير المقطعي البصري الإسقاط هو طريقة من طرق التصوير 3D التي تمكن تقييمات عالية الدقة العينات الطبية الحيوية على نطاق ومم إلى 6 سم. هنا، يمكن استخراج المعلومات المكانية عن موقف وحجم الانسولين الفردية معربا عن جزر لانجرهانز في جميع أنحاء حجم البنكرياس في الفئران العادية والسكري 3،7-10. الهدف من الدراسة الحالية هو مواصلة تعزيز قدرة هذه التقنية لتقييم البنكرياس β خلايا؛ على توزيع الذاتية، عندما المطعمة في الأنسجة الأخرى، علاقتها المكونة البنكرياس الأخرى (مثل التسلل أنواع الخلايا) وأكبر الاستعدادات البنكرياس من ممكنا في السابق.
والتصوير المقطعي بالأشعة تحت الحمراء قرب الإسقاط الضوئي (NIR-OPT) الإعداد
في أدناه البروتوكولات، ماسح الأراضي الفلسطينية المحتلة استنادا إلى مجموعة الأصلي صفت من قبل شارب <eيوصف م> وآخرون 1، تتكيف مع التصوير في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة وتستخدم. لتقييم قناة واحدة في البنكرياس الماوس (على سبيل المثال من BCM)، قد يتم استخدام 3001 SkyScan (Bioptonics) الماسح الضوئي.
مصباح الهاليد المعدنية التي توفر أعلى طاقة الإثارة من مصباح قوس الزئبق في موجات فوق 650nm، لوازم ضوء الإثارة. يتم نقل الضوء من خلال دليل ضوء السائل. وتظهر مزيج من المفيد fluorochromes والمرشحات لتمرير الفرقة NIR مضان التصوير وفصل القناة في الشكل 3. يتم الكشف عن الضوء المنبعث مع كاميرا CCD مضيئة الظهر، مع كفاءة عالية في الكم الطيف NIR. هو الآلي باستخدام المسح الأراضي الفلسطينية المحتلة منصة ابفيف الذي يتحكم في الكاميرا والمحركات السائر. لدعم العينات في حجم الفئران بنكرياسات سليمة، مرآة الفضة المطلية المحمية وكوفيت كبير يستخدم. وأخيرا، حامل العينة أن يلغي movemen العمودي غير المرغوب فيهاتم تصميم TS من العينة أثناء الفحص.
التقنيات الموضحة للتصوير الأراضي الفلسطينية المحتلة تمكن من استخراج المعلمات المكانية والكمية في جميع أنحاء البنكرياس حجم الفئران. وتجدر الإشارة إلى واجب إلى تحديد في القرار تحقيقها لهذا النوع من التصوير جرحشاعثزرحشرتاد أنه، كما لمعظم طرائق التصوير، أكبر عينة انخفاض القرار (على الرغم من أن استخدام CCD دقة أعلى ينبغي زيادة دقة الفحص الأراضي الفلسطينية المحتلة) . وبالتالي، لتقييم سليمة فصوص الماوس البنكرياس، والتقنية في الوقت الحاضر لا يوفر واحدة على الرغم من أن قرار إغلاق الخلية (حوالي 15-20 ميكرومتر) 7. ومع ذلك، لاستخراج توزيع BCM في البنكرياس الماوس قدمت البروتوكولات البيانات أن أكثر من مباراة جيدة تلك التي حصلت عليها نقطة مثل العد الشكلي 3،13 وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من تنفيذ البروتوكول CLAHE يسمح للكشف عن الجزر أكثر بكثير ، وهذه عادة ما تكون أصغر الجزر ولا إسهاماتالشركة المصرية للاتصالات إلى حد كبير في حجم خلايا β بشكل عام.
البروتوكولات المعنية هي المناعى طويلة نسبيا (تصل إلى أسبوعين)، ولكن يد الفعلية في الوقت المحدد لإعداد عينة قصيرة، وبالتالي هي مناسبة تماما للتقنية لدراسة الأفواج الكبيرة من الحيوانات 9. إذا كان من المحتمل أنماط التوزيع غيروي المنشأ هو التركيز لتحقيق ذلك، ينبغي التأكيد على أنه ينبغي توخي الحذر في الخطوات المتعلقة تثبيت وتركيب لتجنب أن يصبح البنكرياس والأنسجة إصلاح بطريقة غير المواتية وشقة ("انتشرت" وينبغي أن تسعى) جبل من الأنسجة للتسهيل مثل هذه التقييمات.
قضية هامة عند تنفيذ الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أن يتم إصلاح COM العينة لفي محور الدوران، وأنه لا يتحرك، إما رأسيا أو أفقيا، أثناء إجراء المسح. ولذلك فمن الضروري أن يكون هناك إعداد مستقرة الميكانيكية ونظام يعمل بشكل جيد لattachiنانوغرام العينة. حللنا هذه المشكلة عن طريق بناء جبل جديدة (الشكل 7).
كان الهندسة موازية لا ينطبق على الأراضي الفلسطينية المحتلة، NIR لدينا أو الماسح الضوئي Bioptonics 3001، والتي تم الكشف على أنه تحول الرأسي بين الظهر والمواقع الامامية من الكائنات المحيطية في صور الإسقاط المسجلة. عن طريق ضبط المسافة إلى كائن مصدر في ملف السجل من الماسح الضوئي منها (انظر 2.3.1) يمكن أن تحسن إلى حد كبير نوعية البيانات المتوفرة لدينا وتصحيح التشوهات الهندسية للفي حواف بكثير من الصور الإسقاط، والتي لها أهمية خاصة عند تقييم العينات أكبر.
في البروتوكول الحالي، ونحن نقدم اقتراحا من مجموعات التصفية التي تسمح التصور من ثلاث قنوات مختلفة ومحددة "التشريح" قناة في تقييم الاستعدادات البنكرياس سليمة. من الواضح أن هذه الإعدادات تكون التضمين لتناسب بشكل أفضل fluorochromes تستخدم لدراسة معينة على الرغم، كما كل أشكال fluoresالمجهر المائة، ينبغي الأخطار المحتملة للإشارة تنزف من خلال تقييم دقيق. دراسة الجزر الأنسولين المسمى مع fluorochromes التي نحن متحمسون فوق 750 نانومتر لم يتسن بعد من قبلنا باستخدام مصباح هاليد المعدنية التي تستخدم لدينا مجموعة لأعلى. فمن الممكن أن كاميرا مع كفاءة أعلى من ذلك الكم في الأطوال الموجية ذات الصلة بالاشتراك مع مصادر الضوء البديل (الصمام الثنائي ليزر مثلا) يمكن أن يزيد من احتمال مزيد من الأراضي الفلسطينية المحتلة نير والسماح للتصوير عند أطوال موجية أعلى من ذلك.
الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أسلوب التصوير تنوعا للغاية لتقييم المكاني والكمي لعينة الطبية الحيوية على مقياس الطول ملم. على الرغم من أن وضعت البروتوكولات المعروضة هنا لغرض الرئيسي من البنكرياس / السكري البحوث ينبغي أن تكون ممكنة لترجمة البحوث إلى على الأنواع الأخرى، وأنواع العينات وعلامات. من القدرة على تصور قنوات متميزة في العديد من الأعمال التحضيرية البنكرياس سليمة، نير الأراضي الفلسطينية المحتلة و التصويرurther تحمل في طياتها احتمال كأداة لتقييم نوعية امتصاص المعدة للعوامل التباين غير الغازية التقييمات من طرائق التصوير الأخرى، ما دام يمكن تصميم هذه العوامل على النقيض من تحمل أيضا fluorophore كشفها بواسطة الأراضي الفلسطينية المحتلة.
The authors have nothing to disclose.
ومن المسلم به الدكتور يندستروم P. لتوفير OB / OB الفئران. ومن المسلم به J. Lehtonen للحصول على المساعدة مع إنتاج الفيديو وجيلبرت J. للمساعدة في التحرير. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من مؤسسة معهد بحوث السكري (AP)، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث (AP وUA)، والمفوضية الأوروبية (FP-7، اتفاقية المنحة رقم: CP-IP 228933-2) (JS و UA)، وأسس كيمبي، جامعة أوميا ومجلس البحوث السويدية لUA
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
Liquid Light Guide | 11504116 | ||
Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |