Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Veel van celbiologie gebeurt via moleculaire interacties van DNA en RNA. ⁴ Deze natuurlijk voorkomende nucleïnezuren (NA) met elkaar, ⁵ eiwitten, ⁶ en met een groot aantal kleine molecule verbindingen en liganden in vivo (bijvoorbeeld tweewaardige kationen ^7). De interacties kan van korte of lange duur (kinetisch), kan variëren van hoog tot matig tot lage affiniteit (thermodynamische sterkte), en kan aanzienlijke variatie vertonen ook in chemische eigenschappen en specificiteit – sommige verenigingen zijn vrij specifiek (bv DNA · · · transcriptiefactoren, RNA · · · splicing factoren), terwijl andere interacties zijn noodzakelijkerwijs veel meer generiek (bv DNA · · · bacteriële histon-achtige HU eiwitten ^8). Niet-specifieke interacties met NAS kan praktische gevolgen hebben voor in-vitro-experimenten met mengsels van biomolecules, aangezien het mogelijk en zelfs waarschijnlijk dat sommige NAs zal associëren met biomoleculen plaats, althans onder een deel van de experimentele omstandigheden gebruikt (ionsterkte, pH, enz.).

Beschouw bijvoorbeeld de productie van een eiwit van interesse (POI) via heterologe over-expressie van het recombinant eiwit in Escherichia coli celcultuur; dergelijke procedure wordt routinematig uitgevoerd in vrijwel elke structurele biologie lab ⁹ In voorbereiding op verdere experimenten dergelijke. als biochemische / biofysische karakterisering, kristallisatie, enz. eerste pogingen algemeen gericht op het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van de POI in zo zuiver mogelijke vorm, idealiter als een chemisch homogene en biofysisch monodisperse specimen. Na onderbreking van de gastheercellen, de vroege stadia van een typische zuivering workflow doel de POI isoleren van E. coli eiwitten, nucleïnezuren, celwand puinen andere onderdelen van het cellulaire lysaat. Echter, gastheer NA kan samenwerken zuiveren met de POI voor verschillende fysisch-chemische redenen – een zeer basic POI kan niet-specifiek pull-down gastheer DNA / RNA, de POI kan een generieke NA-bindende activiteit (bijvoorbeeld de eerder genoemde HU); de POI kan een vrij specifieke NA-bindingseiwit maar vertonen kruisreactiviteit met gastheer RNA of DNA zijn; ontvangende NA kan interageren met een chromatografiematrix en daardoor eenvoudig co-elueren met de POI, enzovoort. Willekeurige, hoge affiniteit binden van gastheer NA naar een POI kan vormen een vervelend probleem, omdat de NA onzuiverheden zal waarschijnlijk interfereren met downstream-experimenten (bijv. fluorescentie anisotropie testen van POI • RNA binding ^10). U kunt ook onverwachte POI · · · NA verenigingen kunnen ook toevallig worden bekeken, als dergelijke interacties verlichten de POI's nucleïnezuur-bindend vermogen. Hoe dan ook, of NA zijn belangrijke componenten of verontreinigingen, moet men eerst kwantificeren enidentificeren type (DNA, RNA) van co-zuivering NAs in voorbereiding downstream experimenten.

Aantal analysemethoden aanwezig voor het detecteren en kwantificeren NAs in een monster. De meeste beschikbare methoden fundamenteel of spectrofotometrische (bijvoorbeeld A ₂₆₀ absorptiewaarden en A ₂₆₀ / A ₂₈₀ verhoudingen), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van thiazool oranje of andere fluorescerende kleurstoffen NA) of colorimetrische (gevoeligheid van nucleosiden om chemische reacties dit rendement chromoforen absorberen in het UV-VIS gebied van het elektromagnetische spectrum), zoals onlangs beschreven door De Mey et al. ^1. echter de cruciale stap van het identificeren van het type polynucleotide RNA of DNA valt buiten het bestek van veel van deze kwantificering benaderingen. Hier geven we een reeks colorimetrische testen snel de soorten NA componenten identificeren in een eiwit monster.

De protocollen die hier beschreven ceen efficiënt worden uitgevoerd zonder extra stappen van het isoleren mogelijke NA onzuiverheden en afhankelijk assay Benedict voor reducerende suikers ¹¹ de orcinol assay voor pentoses ^{12,13, 14,15} en difenylamine reacties van 2'-deoxypentoses (figuren 1 es 2) . De Benedict's test (figuur 2a) gebruikt het vermogen van de lineaire, open keten (aldehyde) vorm van een aldose suiker Cu ² verlagen ^+, met gelijktijdige oxidatie van carbonyl de suiker om een carboxylaat groep en productie van Cu ₂ O als onoplosbare rood neerslag. Deze reactie positief testen vrije reducerende suikers zoals aldoses en ketoses (die converteren naar de overeenkomstige aldosen via enediol tussenproducten), maar niet met pentose suikers die zijn opgesloten in cyclische vorm als deel van het covalente ruggengraat van een DNA of RNA polynucleotide. Door de minimalistische vereiste van een vrije hemiacetal functionaliteit andere compounds die kunnen positief testen bij deze assay – en dus als potentieel interfererende – onder α-hydroxy-ketonen en korte oligosaccharides (bijvoorbeeld de disaccharide maltose). Zowel de Bial de orcinol (Figuur 2b) en Dische de difenylamine (figuur 2c) reacties zijn gebaseerd op initiële vernietiging van de polynucleotide backbone, via depurinering van de nucleoside en verder zuur of base gekatalyseerde hydrolyse van de ouder nucleotiden aan furan-2 oplevert -carbaldehyde (furfural) derivaten, die derivaten vervolgens reageren met ofwel een polyhydroxy fenol zoals orcinol (Bial's) of difenylamine (Dische's) reagentia gekleurde condensatieproducten van veelal onbekende chemische structuur. De DNA versus RNA specificiteit van de assay Dische komt voort uit het feit dat de pentose suiker moet 2'-zuurstofarme om gevoelig voor oxidatie zijn om ω-hydroxylevulinyl aldehyde, die verder reageert met difenylamineonder zure omstandigheden om een heldere blauwe condensaat (2c figuur) op te leveren. Met de gestroomlijnde protocollen beschreven, hebben we gevonden dat deze suiker-specifieke colorimetrische reacties kunnen maken tussen RNA en DNA, en ook de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, ribose of in een biomoleculaire monster.